枯草芽孢杆菌的发酵

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1、枯草芽孢杆菌的发酵学院：化工学院 专业：生物工程 班级：生物 10-2摘要枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的15种菌种之一 ,其已被 越来越多地制成饲用微生态制剂。因其制剂是无毒、无残留、无污染的“绿色” 添加剂，故具有广阔的发展前景，并已在畜牧业、饲料业广泛应用，显示巨大的 社会效益和生态效益。通过摇床培养筛选出较适宜于枯草芽孢杆菌发酵的培养基 配方，发酵培养基配方确定后，在摇床条件下，通过对温度、初始pH值、初始 接种量、装液量、摇床转速等发酵条件的摸索，确定最佳发酵条件。在摇瓶条件 下优化发酵培养基和发酵工艺后，采用发酵罐进行发酵培养，对枯草芽孢杆菌在 液体发酵过程中的菌体数量

2、、PH值、总糖含量和总氮含量四个因素随时间的变 化进行了观察。枯草芽抱杆菌，是芽抱杆菌属的一种。单个细胞0.70.8X23微米，着 色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽抱0.60.9X1.01.5 微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽抱形成后菌体不膨大。菌落表面粗 糙不透明，污白色或微黄色。枯草芽抱杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多 粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些物质对致病菌或源性感染的条件 致病菌有明显的抑制作用。枯草芽抱杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低 氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH值，间接抑制 其它致病菌生长。枯草芽抱杆菌

3、菌体自身合成a-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤 维素酶等酶类，在消化道中与动物体的消化酶类一同发挥作用，能合成维生素 B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体干扰素和巨噬细胞的活性，在 饲料中应用广泛。它还可以用来改善水质，应用在污水处理和环境保护中。和其 它微生物混合使用，还可以用于生物肥料和土地改良等关键词：枯草芽抱杆菌 生长 发酵 活菌数第一章 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种枯草芽孢杆菌1.1.2 培养基(1) LB培养基：蛋白胨10g,酵母膏5g, NaCllOg，蒸馏水1000ml, pH为7, (可溶性淀粉20g)琼脂20g。(2) 筛选用培养基：含有2%可溶性淀粉的

4、LB培养基。(3) 种子培养基：豆饼粉 4%,玉米粉 3%,Na2 HPO40.8%,(NH4)2 SO40.4%,NH4 Cl0.15%, H2 O。(4) 发酵培养基：豆饼粉 5.6%,玉米粉 7.2%,Na2 HPO4 0.8%,(NH4 )2 SO4 0.4%, NH4 C10.13%, CaCl 2 0.13%,a淀粉酶 50g。1.1.3 主要试剂 蔗糖、葡萄糖、淀粉、玉米淀粉、麦芽糖、酵母浸出物、胰蛋白胨、牛肉膏、尿 素、氯化铵、硫酸锰、硫酸镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸亚铁、氯化钠和 氯化钙。1.1.4 仪器设备控温摇床、高压蒸气灭菌锅、电子天平、pH测定仪、无菌操作台和紫外

5、分光光 度计。1.2 方法1.2.1 培养基的制备(1) 称量按培养基配比依次准确地称取酵母膏、NaCl、蛋白胨放入烧杯中，并在烧杯 中加入少量蒸馏水。注：酵母膏常用玻棒挑取,放在小烧杯或表面皿中称量,用 热水溶化后倒入烧杯,也可放在称量纸上,称量后直接放入水中,这时如稍微加 热,酵母膏便会与称量纸分离,然后立即取出纸片。(2) 溶化 可溶性淀粉溶液的配制方法：将所需克数的可溶性淀粉放入一个小烧杯中,加入少量蒸馏水,搅拌成糊状,然后将糊状溶液均匀倒入少于培养基总体积的沸 水中,一边搅拌一边加热,待其溶化成透明状后继续在电炉上加热5分即制成可 溶性淀粉溶液。如果配制固体培养基时，将已准备好的可溶

6、性淀粉溶液倒入烧杯中，将称好 的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，补水到所需的总体积。在制备用三角瓶 盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按 2%的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同 步进行，节省时间。在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时，需 不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。配制培养基时，不能用铜或铁锅加热溶化，以免 离子进入培养基中，影响细菌生长。(3) 调 pH培养基配好以后，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH,如果偏酸，用滴 管向培养基中逐滴加Imol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，

7、直到 pH达7为止；反之，用lmol/LHCl进行调节。对于有些要求pH较精细的微生物，其pH的调节可用酸度计进行。注意：pH不要调过头，以避免回调而影响培养基各离子的浓度，配制pH低 的琼脂培养基时，若预先调好pH并在高压蒸汽下灭菌，则琼脂因水解不能凝固， 因此应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌，再 调整 pH。(4) 分装按照实验要求，可将配置的培养基分装入试管或三角瓶中。 液体分装：分装的高度以试管高度的 1/4 左右为宜；分装三角瓶的量则根据需要 而定，一般以不超过三角瓶的一半为宜。固体分装：分装于试管中的应不超过试管的1/5，灭菌后制成斜面；分装三 角瓶的

8、量以不超过一半为宜。(5) 加塞培养基分装完毕后，在试管口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基而 造成污染，并保证有良好的通气性能。(6) 包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时 冷凝水润湿棉塞，外边再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称，组别，配 制日期。三角瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结扎好，使用时容易解开，同 样注明。(7) 灭菌将配置好且包扎完毕的固体、液体培养基及本实验涉及的试管、三角瓶等及 400ml纯水于高压灭菌器中以0.14Mpa, 121C条件下高压蒸汽灭菌20分钟。(8) 斜面搁置将培养基冷却至50C左右时放置斜面，斜面在试管的1/2

9、处为宜，待斜面 凝固后,放置于冰箱中待用。1.2.2 菌种的筛选与保藏(1) 倒平板将实验配制好的培养基加热溶化，待冷却至5560C时，倒平板9皿。(2) 稀释用接种环取菌种，放入盛 90ml 无菌水的三角瓶中，振摇。用一支 1ml 无菌 吸管吸取1ml菌液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从 此试管中吸取 1ml 加入另一盛有 9ml 无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的菌液。(3) 划线将平板底面分别用记号笔写上 10-4、10-5、10-6三种稀释度(共三组)然后 用接种环分别沾取浓度为10-4

10、、10-5、10-6稀释液并对号在相应平板上划线，室 温下静止510min，使菌液吸附进培养基。(4) 培养将培养基平板倒置于37C的培养箱中，培养23天，观察淀粉圈。对有淀 粉圈的菌落，测量淀粉圈的直径D，菌落直径申，计算-的比值，可进行拍照， 选择淀粉圈较大的菌落作为后续实验的菌种。(5) 接种接种到斜面培养基中，标注上日期等信息。放入恒温培养箱中培养作为一级 种子。(6) 保藏斜面置于37C的培养箱中，培养23天，观察菌种长势好坏，若菌种长势 好则将其放入冰箱中保藏，若长势不好则需多次斜面转接。1.2.3枯草芽孢杆菌生长曲线测定(1) 取12支无菌大试管，用记号笔分别标明培养时间即12,

11、13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 和 23h。(2) 接种用1ml无菌吸管吸取2ml枯草芽抱杆菌培养液(培养1012h)转入盛有lOOmlLB 液的三角瓶，混合均匀。(3) 培养将已接种的三角瓶放置37C振荡培养(振荡频率为100r/min)分别在培养 12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21,22和23h时，用无菌吸管吸取1ml菌液放入 标有相应时间的无菌试管中，立即放入冰箱中储存，最后一同比浊测定光密度值。(4) 比浊测定用无菌水作空白对照，选用660nm波长进行光电比浊测定，从早取出的培养液开 始依次测定，对细胞密度大的培养液用无菌水适当稀释

12、后，使其光密度值在 0.10.65 之的生长情况。菌体进入对数生长期即可作为二级种子液用于分批培 养发酵实验。(测定 PH 值前，将待测定的培养液震荡，使细胞均匀分布)。PH 值测定结果培养时间(h)12345678PH值6.56.76.97.17.37.06.86.41.2.4 菌种摇瓶培养(1) 称量 根据需要量计算并依此称取豆饼粉、玉米粉、Na HPO、(NH ) SO、2 4 4 2 4 NH Cl放入三角瓶中，配成200ml溶液。4(2) 加塞包装。(3) 灭菌 0.14Mpa, 121C,20min。(4) 接种 接种前一级种子需先放在恒温培养箱活化(37C、12h),冷却后接 种

13、。(5) 培养 放入气浴恒温振荡器中37C,100r/min培养13h后，镜检，观察菌的生长情况。菌体进入对数生长期即可作为二级种子液用于分批培养发酵实验。1.2.5产a淀粉酶枯草芽抱杆菌分批培养发酵(1) 称量 根据需要量计算并依次称量豆饼粉、玉米粉、Na HPO、(NH ) SO、2 4 4 2 4NH Cl、CaCl、a淀粉酶，放入发酵罐中加入蒸馏水配制2.5L发酵液。42(2) 灭菌 0.14Mpa，121C,20min。(3) 接种(4) 启动发酵罐，调节发酵系数，开始发酵。发酵参数：温度37C转速200r/min通气量1.33VVm(012h)2.67VVm (12h发酵结束)pH

14、 值6.5(5) 测PH值，绘制生长曲线，并进行镜检，观察菌体生长状况。(6) 发酵结束，放罐。第二章 结果与分析2.1 菌种筛选及保藏由于实验要筛选的菌种已经很纯了，所以此次实验所提到的“筛选”，是要 筛选出有活力的、生长状态良好的纯种枯草芽孢杆菌。通过加入少量的可溶性淀 粉酶，可以使菌种进行选择性培养，这样筛选出来的菌株可以更好地产a淀粉 酶。筛选出来的菌种要进行保藏，此实验的保藏方法是放在冰箱中保藏。2.2 扩大培养此次实验采用一次扩大培养，方法是摇瓶培养。扩大培养用的培养基与发酵 培养基相似。在气浴恒温振荡器中，发现摇瓶中变浑浊，而且表面有很多气泡， 这说明菌体开始生长了。培养特定时间

15、后，生长出来的菌种就可以用于发酵了。 2.3 发酵发酵采用的方式是分批培养发酵，在一切做好准备后，进行无菌操作，把菌 体放入发酵罐中进行发酵。整个过程都是需要时刻进行调节的，主要的调节项目 为温度、pH值，因为菌体在生长的各个阶段，温度和pH都有所变化，而想要生 产出产品，就要控制好这两个参数。温度控制主要通过加冷却水来进行，但要注 意适量，不能太过。pH值的控制主要通过加氨水来调节，因为随着菌体生长和 产物产生，环境pH值会不断下降呈酸性，所以要不断加氨水来控制。第三章 结论枯草芽孢杆菌在培养过程中，由于培养条件掌握不好，常出现活菌数量低， 芽孢形成率低等问题。本研究通过一系列单因素实验,确定了枯草芽孢杆菌的最 佳发酵条件。通过对枯草芽孢杆菌进行筛选、扩大培养和发酵的控制，很好的了 解了生物产品生产的中游部分的各个步骤，初步学习了这几部分的主要注意事 项，尤其对发酵有了一个初步的认识，学会了控制发酵的相关参数。通过测量 PH 值，也了解了菌体的生长趋势。培养基优化方法多是在单因素水平试验的基 础上进行正交实验设计或是在正交试验基础上应用均匀设计理论，或者采用通用 旋转组合设计，均能对培养基优化取得较好的效果。在工业化生产中，还需要对 接种量、pH、温度、转速、通风比、溶氧