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1、Q-PCR实验流程一、实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/ 一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。取EP管/枪头时需用镊子，不可以 用使用过的手套直接取用。取完 EP管/枪头后，袋子及时封好。橡 胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移 液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75聽醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不 要在超净台前讲话。二、总RNA抽提1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol（In vitro
2、ge n ）溶液，吹打混匀，并吸至 1.5ml RNasefree EP管中使细胞充分裂解，室温静置 5min；组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol（In vitroge n ）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）2）加入200卩l氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室 温静置3-5min ；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺 序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）3） 4 C下，14,000g离心15min,可见分为三层，RNA在上层水相，移至 另一个新的RNase free EP管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸
3、上清时, 枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）4）沉淀RNA加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒 6-8次）（不 应用振荡器混匀），室温静置 10min；5）4C下，14,000g离心10min,收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底 部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4C下，14,000g离 心10min，收集RNA沉淀），去上清：6） 用75%乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠 倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干：沉淀不 能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。7）视沉淀量加入适量DEPC水 （至
4、少15ul ）溶解沉淀 三、去基因组使用RNase-free的DNase ? （Promega，按以下体系配置反应液,37C消化 30min，65C灭活 10min。RNA30卩lDNase ?20卩l10 x buffer10卩lH2O(RNase free)39.卩lRNasi n5卩l0.5总体积100卩l然后按以下步骤操作：1）加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置 5min，后 14,000rpm，离心 15mi n，取上清。2）加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后14,000rpm，离心15mi n，取上清。3）加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次），-20
5、 C静置15min；4）4C下，14,000g离心15min,收集RNA沉淀，去上清；5）用75%乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）,超净台风干；6）加入适量DEPCK（至少15ul ）溶解沉淀。四、总RNA屯度和完整性检测1）纯度检测：取1卩l RNA样品50倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定 OD值， OD6/OD80的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。2）总RNA完整性检测：取RNA羊品1卩l，1%琼脂糖凝胶电泳80VX 20min, EB 染色10min,用凝胶成像系统观察并拍照，总 RNA勺5s rRNA，18s rRNA和 28s rRNA条带，三条条带完整的
6、话即可证明总 RNA抽提比较完整。五、逆转录1. mRNA1）在RNase free的PCR管中配置下列溶液.Total RNA卩 gH2O1.0 卩 l总体积12 卩l打均匀，置85 CRNA变性。随后以防止RNA复2）将上述溶液吹保温 5min，使 立即冰上致冷， 性；3）在该PCR管中加入下列试剂（Promegaoligo (dT)0.5卩lRan dom primer0.5卩l10mM dNTP2.0卩lRNase in hibitor0.5卩l5 x buffer4.0卩lM-MLV0.5卩l总体积8.0卩l4) 将上述20卩l反应溶液30C保温10min；5) 42 C 保温 50
7、min；6) 85C保温 10min；7) -20 C 保存。2. microRNA :2）将上述溶85 C孵打开RNAtotal RNAX个miR逆转录引物H2O1.00.5*X卩g卩l随后立总体积12.5卩l上，以防使用茎环逆转录法，原理如下图：1）在去RNase的 PCRt中配置以下溶液液混匀，育5min，以 二级结构。即置于冰止RNA复性再次恢复二级结构；3）在另一去RNase的PCRt中配置以下溶液:10mM dNTP (promega)2.0卩lRNase in hibitor (promega)0.5卩lU6逆转录引物0.5卩l5x buffer4.0卩lM-MLV (prome
8、ga)0.5卩l总体积7.5卩I4）将3）溶液加入到1）溶液中，混匀后30C保温10min；5）42C 孵育 50min；6）85C孵育10min灭活逆转录酶。四、定量PCR佥测1.引物测试：根据mRN般计的引物正式实验前需进行qPCRM试其特异性和扩增效率，具 体反应体系和反应条件如正式实验，每对引物需做模板水对照。得到结果后，首先根据熔解曲线判断引物特异性， 选择标准为：单峰且峰形 偏窄、水对照无明显引物二聚体熔解曲线峰。 若设计的多对引物熔解曲线均显示 特异性良好，则应对比各引物的扩增曲线，优先选择Ct值小、扩增效率高的引物进行正式实验。2 确定上机内容后，首先在记录本上编排好上机的样品
9、排放顺序。（1） 一个样品的加样尽可能安排在同一行（2）如正式实验中三次重复不能安排在同一板上， 则需把三次重复中的实验分开，但同一次重复的实验不能分开两板3 正式实验：体系配制：H2O4ulSYBR Green PCR Master Mix10ul （TOYOBO）（使用前需振荡均匀）上游引物0.5ul(10uM下游引物0.5ul(10uM总体积15ul计算好实验中需用多少份体系，则按具体量配置。体系分装会有损失，一 般多配0.5份-1份体系。总的体系配好后，在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀， 然后15ul每管分 装至8连管中。3. cDNA用灭菌纯水稀释适当的浓度，一般为 1:20稀释，如
10、遇到基因表达低的 样品，则适当降低稀释比例至1:10或1:5。cDNA按一定顺序排好后，即可加至 刚配好的反应体系中。加样完毕，盖好八连管盖，并在八连管盖最上沿的边上标 记好1-12的顺序（不可将标记写在反应管的盖子上，八连管盖避免裸手触摸中间透明的荧光采集区域， 且保证每孔均盖紧， 否则影响重复性或可能出现熔解曲 线峰漂移。）4把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒。五上机：5.1 先开电脑，进入 Windows界面。接着打开PCF仪电源开关。5.2 打开7500软件，选择“新建”，在“ Template”下拉菜单中选择“ 60”或“65” （普通基因检测为“ 60”，MicroRNA检测为“
11、 65”）5.3 打开样品架，放入八连管，关上样品架，并在软件上选择已放反应管的孔 位，剔除无反应管的孔位。5.4 点击File菜单中Save,输入要保存结果的文件名，命名为日期-上机时间-客户名字简写，如100830-1008-WL表示8月30日10点08分魏立的实验。5.5 点击 Start 键，开始运行程序。5.6 程序运行完毕后， 取出样品架上的八连管， 按顺序关闭 ABI PRISM7500 SDS 软件、PCF仪电源开关。5.7 在7500软件上标记好每个反应孔的样品名称及检测基因的名称， 分类保存 好结果文件。反应完成后，八连管应装到封口袋中，袋子上标记好文件名，客户的名字。 （同 一个客户的三次重复实验， 则只需保存其中一次重复的反应管即可， 其余可丢弃）
