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1、1.液氮法目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器。细胞冻存时常备的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%20%的血清培养液，DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油（121C蒸气高压消毒），2mL安瓿（或专用细胞冻存管）、吸管、离心管、喷
2、灯、纱布袋（或冻存管架）等。主要操作步骤为：（1）选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25%胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心（1000r/min,10分钟）。（2）去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4C预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3X1061X107/mL之间。（3）将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中，安瓿装11.5mL在火焰喷灯上封口
3、，封口处要完全封闭，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记（日期、细胞种类及代次、冻存支数）。（4）将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内；置于液氮容器颈口处存放过夜，次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤：先将安瓿置入4C冰箱中23小时,再移至冰箱冷冻室内34小时（此步可省略），再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时，最后沉入液氮中。2.分布降温法（深低温冰箱法）细胞系冻存程序：1）单层细胞的消化。将经2448小时培养已长成单层的传代细胞培养物弃去生长液，加适量ATV，12分钟后倒弃ATV，再加入少量ATV液,经0.51分钟倒去ATV，室温或37oC
4、温箱作用23分钟，视细胞解离情况，拍打细胞培养瓶。使单层细胞完全解离。SP2/0瘤细胞，待生长好后用吸管吹打，再经1000转/分离心1O分钟。2) 离心洗涤：向培养瓶内加51Oml预冷的MEM使细胞悬浮，再将其吸出置灭菌离心管中，以1OOOrpm离心810分钟后弃去上清液。3) 细胞悬液的制备：向离心管内逐滴缓慢加入预冷的冻存保护液，使细胞浓度为l50400万/ml,然后迅速分装于安瓿瓶中，每瓶加量为lml。4) 致冷冻结：将安瓿瓶放入带有棉垫的纸盒或塑料盒内，直立置不同条件下致冷冻结果保存：a、4oC两小时后移至一2OoC作用2小时，再移入一4OoC4小时后在一7OoC下24小时投入液氮。b
5、，一20oC4小时后移致一4OoC。C经4小时移人一7OoC冰箱24小时，投入液氮。c、一4OoC4小时后移入一70oC24小时后投入液氮。d、一20oC4小时后移入一70oC经24小时后投入液氮中。e、一70oC24小时后投入液氮中。5) 液氮中保存：将冻结后的安瓿装入预冷的小布袋中，投入液氮。为防止安瓿漂浮，可预先在小布袋中加入几块小卵石。3.玻璃化法玻璃化保存(Vitrification)是一种超速冷冻方法。它是以极快的速度冷冻细胞，使细胞内外的游离水迅速形成玻璃样物质，而不形成冰晶。这种保存方法既避免了由于慢速降温时导致的盐浓度升高，又防止了由于冰晶形成造成的物理损伤，可获得较高存活率。玻璃化首先由Luyet在1937年提出，他认为生命是生物活体系统的原子或其他结构元的一种特殊排列并且轻微的排列位置扰动就会破坏平衡从而导致死亡，而结冰时的驱动力会破坏这种特殊的排列，这就是冰冻死亡的原因。玻璃化比冻结固化方法引起的结构变化要小，因而是一种较理想的低温保存途径。1981年,Fahy首先明确提出，用高浓度的低温保护剂溶液，可在较慢地冷却速率以及高压条件下实现完全的玻璃化，以后又发展了一些所谓“玻璃化溶液”，使细胞、组织乃至器官等范围广泛的生物系统玻璃化低温保存成为可能。1985年，Rail和Fahy目用这种玻璃化溶液使鼠胚胎玻璃化保存获得成功，是这种技术走向实用化的首次突破。
