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1、河北省马铃薯早疫病菌群体遗传结构的研究张福光 杨志辉 朱杰华* 张宏磊 魏巍河北农业大学植物保护学院 河北 保定 071000摘 要：通过对20092010年河北省145株及外省30株马铃薯早疫病菌对代森锰锌的敏感性、产孢量两个表型性状和AFLP基因型的测定，揭示了河北省早疫病菌群体的遗传结构。毒力测定表明所有供试菌株对代森锰锌均表现敏感，其EC50范围介于1.044.86g/mL之间，平均为2.93g/mL。被测河北省47株早疫病菌产孢量平均为85个孢子/mm2，大大高于30个对照菌株的产孢量，对照菌株的平均产孢量为50个孢子/mm2，菌株间产孢量存在明显差异。AFLP聚类分析揭示出了马铃薯
2、早疫病菌丰富的遗传多样性，每个菌株都具有独特的AFLP基因型。早疫病菌AFLP基因型与地理来源存在着密切的相关性，与菌株产孢量有一定的相关性，但与代森锰锌敏感性无相关性。关键词：茄链格孢，代森锰锌，产孢量，扩增片段长度多态性Population structure of Alternaria solani on potato in Hebei ProvinceZHANG Fu-Guang YANG Zhi-Hui ZHU Jie-Hua* ZHANG Hong-Lei WEI WeiCollege of Plant Protection, Agricultural University of
3、Hebei, Baoding, Hebei 071000, ChinaAbstract: The population genetic structure of 145 isolates of Alternaria solani collected from potato in Hebei Province and 30 ones in other four provinces in China from 2009 to 2010 was revealed by phenotypes such as virulence of Mancozeb and sporulation capacity
4、in combination with AFLP genotype. The test of virulences showed that all tested isolates of A. solani were sensitive to Mancozeb, with EC50 values of 1.044.86g/mL, averaging 2.93g/mL. Average sporulation quantity of the tested 47 isolates in Hebei Province and 30 ones in other four provinces used a
5、s control were 85 and 50 conidia/mm2 repectively, showing significant difference. AFLP genotypes revealed a high diversity of A. solani collected from potato and each isolate had a specific AFLP genotype. AFLP genotype of isolates was closely related to the geographic origin, and related to a certai
6、n extent to sporulation quantity, but not correlated with sensitivity of mancozeb to pathogen.Key words: Alternaria solani, Mancozeb, sporulation quantity, AFLP近年来，马铃薯早疫病已逐渐成为河北省马铃薯主产区的一种为害严重的重要病害，给当地马铃薯生产造成了巨大损失。已引起现代马铃薯产业技术体系专家组、马铃薯病害专家、马铃薯生产单位以及管理部门的高度重视，已将其列为“十二五”期间马铃薯病害上急需解决的重点生产难题。该病由茄链格孢Alter
7、naria solani侵染引起（Ellis & Martin 1882）。该菌在我国分布亦十分广泛，几乎遍布各个省、市、自治区，可以引起多种植物病害（张天宇 2003）。以前由于茄链格孢引起的病害一般为害程度较轻，以至于对病原菌有关群体生物学特性方面的研究相对较少，为了更好和更有效地防控河北省日趋严重的马铃薯早疫病，对病原菌群体遗传学研究显得十分重要。病原菌群体结构与病害的发生密切相关，了解马铃薯早疫病菌产孢量、对药剂的敏感性及其基因型，可为深入分析马铃薯早疫病发生与流行规律提供依据（Rotem 1994）。国外学者已将同工酶、RAPD、RFLP和AFLP等分子标记技术应用于马铃薯早疫病菌及
8、相关种类的遗传多样性研究。Petrunak & Christ（1992）研究结果表明，同工酶技术不适于分析早疫病菌种内的遗传差异。Weir et al.（1998）的研究表明，RAPD标记可鉴别出不同寄主的早疫菌，但不能区分不同地理来源地菌株。Sharma & Tewari（1998）利用RAPD技术分析了寄生于十字花科的3种链格孢属真菌Alternaria brassicae，A. brassicicola和A. raphani，发现其基因型分化和地理来源密切相关。Adachi et al.（1996）通过RFLP标记技术分析了A. alternata遗传多样性和其对杀菌剂抗性之间的关系，结
9、果表明二者之间并没有明显关系。Martnez et al.（2004）利用AFLP技术分析了早疫病菌的遗传多样性，发现AFLP分子标记适用于早疫病菌的遗传多样性分析，病原菌具有丰富的多样性，其遗传多样性与地理来源和寄主有一定相关性。然而，我国对马铃薯早疫病的研究仍停留在初级阶段，主要集中在室内毒力测定和田间药效防治，此外还有一些与寄主抗病性有关的零星报道。梁伟伶等（2009）通过室内试验筛选出了抑制马铃薯早疫病的药剂，代森锰锌与嘧菌酯9:1混配时抑制效果最好，其EC50小于1g/mL；刘洋等（2006）研究发现草酸、KCl、FeSO4均可诱导马铃薯块茎产生对早疫病的抗性；台莲梅等（2010）研
10、究发现PAL、POD、PPO和CAT这4种防御酶与马铃薯对早疫病的抗病性有一定关系；张振粉等（2010）对番茄早疫病菌致病力进行了初步研究。然而，在我国有关马铃薯早疫病菌群体结构方面的研究未见报道。本研究拟通过测定马铃薯早疫病菌对代森锰锌的敏感性、产孢量以及AFLP基因型，揭示河北省马铃薯早疫病菌的遗传多样性，分析不同区域早疫病菌对代森锰锌的敏感性、产孢量和AFLP基因型之间的关系，为探讨河北省马铃薯早疫病菌近年来发生流行规律的变化以及防治提供参考。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 供试菌株：供试马铃薯早疫病菌均由本研究室自田间采集的具同心轮纹的典型早疫病症状的病叶经组织分离法分离获得（方
11、中达 1998）。供试菌株共计175株，其中河北省菌株包括3市11县共145株，河北省外的对照菌株30株，其采样时间、地点及菌株数目等信息见表1。1.1.2培养基及试剂：PCA培养基参考张天宇（2003）的配方，经改良后每1,000mL中含马铃薯20g和胡萝卜20g。80%代森锰锌为美国陶氏益农公司产品。1.2 代森锰锌对早疫病菌的毒力测定采用菌落直径法测定代森锰锌对早疫病菌的毒力，计算EC50（梁伟伶等 2009）。1.3 早疫病菌产孢量的测定将早疫病菌置于PCA培养基上，25光照培养（16h光照，8h黑暗）7d（Fourtouni et al. 1998；Rotem & Esther 19
12、69）。由于马铃薯早疫病菌产孢量很低，制成孢子悬浮液很难观测，所以本研究采用将培养皿直接置于显微镜下进行，每皿取20个视野（1010倍下每个视野下观察到的实际面积为0.25mm2）计算单位面积（mm2）分生孢子个数（n）。当0n40时，界定为I级；40n80，界定为II级；n80，界定为III级（Charlton 1953）。1.4 AFLP分析马铃薯早疫病菌基因组DNA提取采用改表1 供试马铃薯早疫病菌菌株的信息Table 1 Information of Alternaria solani collected from potato in the test年份Year地点Location数
13、量No.年份Year地点Location数量No.2010河北保定涞源Laiyuan, Baoding, Hebei62010河北张家口万全Wanquan, Zhangjiakou, Hebei112010河北承德丰宁Fengning, Chengde, Hebei82009河北张家口张北Zhangbei, Zhangjiakou, Hebei52009河北承德围场Weichang, Chengde, Hebei52010河北张家口张北Zhangbei, Zhangjiakou, Hebei202010河北承德围场Weichang, Chengde, Hebei172009内蒙古呼伦贝尔扎兰屯
14、Zhalantun, Hulunber, Inner Mongolia52010河北承德隆化Longhua, Chengde, Hebei12009内蒙古包头达茂Darhan Muminggan, Baotou, Inner Mongolia52010河北张家口尚义Shangyi, Zhangjiakou, Hebei172009陕西榆林定边Dingbian, Yulin, Shaanxi52010河北张家口怀安Huaian, Zhangjiakou, Hebei122009黑龙江齐齐哈尔克山Keshan, Qiqihar, Heilongjiang52010河北张家口康保Kangbao, Z
15、hangjiakou, Hebei122009黑龙江大兴安岭加格达奇Jiagedaqi, Da Hinggan Ling, Heilongjiang52010河北张家口崇礼Chongli, Zhangjiakou, Hebei162009云南昆明西山Xishan, Kunming, Yunnan52010河北张家口沽源Guyuan, Zhangjiakou, Hebei15良的CTAB法（Pipe et al. 2000）。AFLP反应体系参考Vos et al.（1995）和Martnez et al.（2004）的方法，并略作改进。预扩增采用E+1和M+1引物组合（E-A/M-A），选择性扩增采用E+2和M+2的3对引物组合（E-AA/M-GA，E-AG/M-AG和E-AT/CC）。扩增产物采用毛细管荧光电泳技术进行分离检测。扩增条带采用生物学统计软件NTSYSpc 2.1进行分析。数据录入NT edit 1.2获得数据组，利用Similarity程序组中的SimQual程序计算相似系数（SM），利用SHAN程序采用不加权算术平均数法（UPGMA）对数据进行聚类分析，构建树状聚类图。2 结果与分析
