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1、气相色谱中的内标法与外标法内标法与外标法一、内标法 什么叫内标法？如何选择内标物?内标法是一种间接或相对的校准措施。在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校谁和消除出于操作条件的波动而对分析成果产生的影响,以提高分析成果的精确度。 内标法在气相色谱定量分析中是一种重要的技术。使用内标法时，在样品中加入一定量的原则物质,它可被色谱拄所分离，又不受试样中其他组分峰的干扰，只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值,即可求出待测组分在样品中的百分含量。采用内标法定量时,内标物的选择是一项十分重要的工作。抱负地说,内标物应当是一种能得到纯样的己知化合物,这样它能以精确、已知的量加到样品中去
2、，它应当和被分析的样品组分有基本相似或尽量一致的物理化学性质(如化学构造、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等、色谱行为和响应特性,最佳是被分析物质的一种同系物。固然，在色谱分析条什下，内标物必须能与样品中各组分充足分离。需要指出的是，在少数状况下，分析人员也许比较关怀化台物在一种复杂过程中所得到的回收率，此时,她可以使用一种在这种过程中很容易被完全回收的化台物作内标,来测定感爱好化合物的百分回收率,而不必遵循以上所说的选择原则。 在使用内标法定量时,有哪些因素会影响内标和被测组分的峰高或峰面积的比值? 影响内标和被测组分峰高或峰面积比值的因素重要有化学方面的、色谱方面的和仪器方面的三类。由化学方
3、面的因素产生的面积比的变化常常在分析反复样品时浮现。化学方面的因素涉及: 1、内标物在样品里混合不好； 、内标物和样品组分之间发生反映, 、内标物纯度可变等。 对于一种比较成熟的措施来说,色谱方面的问题发生的也许性更大某些，色谱上常用的某些问题(如渗漏对绝对面积的影响比较大，对面积比的影响则要小某些，但如果绝对面积的变化已大到足以使面积比发生明显变化的限度，那么一定有某个重要的色谱问题存在，例如进样量变化太大,样品组分浓度和内标浓度之间有很大的差别,检测器非线性等。进样量应足够小并保持不变，这样才不致于导致检测器和积分装置饱和。如果觉得措施比较可靠,而色谱固看来也是正常的话,应着重检查积分装置
4、和设立、斜率和峰宽定位。对积分装置发生怀疑的最有力的证据是：面积比可变,而峰高比保持相对恒定， 在制作内标原则曲线时应注意什么?在用内标法做色话定量分析时，先配制一定重量比的被测组分和内标样品的混合物做色谱分析，测量峰面积,做重量比和面积比的关系曲线，此曲线即为原则曲线。在实际样品分析时所采用的色谱条件应尽量与制作原则曲线时所用的条件一致，因此,在制作原则曲线时，不仅要注明色谱条件(如固定相、柱温、载气流速等，还应注明进样体积和内标物浓度。在制作内标原则曲线时，各点并不完全落在直线上，此时应求出面积比和重量比的比值与其平均位的原则偏差,在使用过程中应定期进行单点校正,若所得值与平均值的偏差不不
5、小于,曲线仍可使用，若不小于2,则应重作曲线,如果曲线在铰短时期内即产生变动,则不适宜使用内标法定量。二、外标法 用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的措施称为外标法。此法可分为工作曲线法及外标一点法等。工作曲线法是用对照物质配制一系列浓度的对照品溶液拟定工作曲线，求出斜率、截距。在完全相似的条件下，精确进样与对照品溶液相似体积的样品溶液,根据待测组分的信号，从原则曲线上查出其浓度,或用回归方程计算，工作曲线法也可以用外标二点法替代。一般截距应为零，若不等于零阐明存在系统误差。工作曲线的截距为零时,可用外标一点法(直接比较法定量。 外标一点法是用一种浓
6、度的对照品溶液对比测定样品溶液中i组分的含量。将对照品溶液与样品溶液在相似条件下多次进样，测得峰面积的平均值,用下式计算样品中i组分的量： W=A（/（ 式中W与A分别代表在样品溶液进样体积中所含组分的重量及相应的峰面积。(W及（A分别代表在对照品溶液进样体积中含纯品i组分的重量及相应峰面积。外标法措施简便，不需用校正因子，不管样品中其她组分与否出峰,均可看待测组分定量。但此法的精确性受进样反复性和实验条件稳定性的影响。此外，为了减少外标一点法的实验误差，应尽量使配制的对照品溶液的浓度与样品中组分的浓度相近。 外标法 eternal tndrd mthod 色谱分析中的一种定量措施,它不是把原
7、则物质加入到被测样品中，而是在与被测样品相似的色谱条件下单独测定,把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。外标物与被测组分同为一种物质但规定它有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被测物浓度相接近，以利于定量分析的精确性。三、定量分析中如何选择内标法或外标法(来源:药物分析网） 选一与欲测组分相近但能完全分离的组分做内标物(固然是样品中没有的组分），然后配制欲测组分和内标物的混合原则溶液，进样得相对校正因子。再将内标物加入欲测组分的样品中,进样后测得欲测组分和内标物的定量参数。用内标法公式计算即可。 内标法是将一定量的纯物质作内标物，加入到精确称量的试样中，根据被测试
8、样和内标物的质量比及其相应的色谱峰面积之比，来计算被测组分的含量。 选择内标物有4个规定:1.内标物应是该试样中不存在的纯物质;2.它必须完全溶于试样中，并与试样中各组分的色谱峰能完全分离；3.加入内标物的量应接近于被测组分；.色谱峰的位置应与被测组分的色谱峰的位置相近,或在几种被测组分色谱峰中间。 内标法的长处是测定的成果较为精确，由于通过测量内标物及被测组分的峰面积的相对值来进行计算的，因而在一定限度上消除了操作条件等的变化所引起的误差。内标法的缺陷是操作程序较为麻烦，每次分析时内标物和试样都要精确称量，有时寻找合适的内标物也有困难。 外标法简便，但进样量规定十分精确,要严格控制在与原则物
9、相似的操作条件下进行，否则导致分析误差,得不到精确的测量成果。 内标与外标都是定量的一种措施而已，至于哪一种措施好与不好不能一概而论,做不同的分析，面对着不同的规定，再加上分析成本分析效率等等问题,我想简朴而有效进行定量分析来满足规定才是最重要的。1、此前做过诸多医药、农药中间体的芳香族卤代化合物的常量定量分析，没有自动进样器，用外标法定量,的确重现性与稳定性非常差，成果常常受到搞合成同事的质疑。其实,仔细分析因素不一定就是外标法不适合这种定量分析,一方面我们的实验室仪器和手段与否调节到一种稳定而合理的状态了，例如，衬管与否干净,玻璃棉的位置与否合适恰当(能否使样品尽量的汽化）、汽化温度与否合
10、适、色谱峰形与否对称(也就是样品与色谱柱健合相与否匹配）、附近有无其他色谱峰的干扰、选用什么进样方式(如迅速进样还是热针进样)等等因素的影响都需要考虑,如果这些因素都考虑了,按照GMP措施验证对于精密度的规定，同同样品进6针以上的RSD和配制个样品的定量成果R都能满足不不小于1%的规定,那么这个措施用外标法就是完全合用的，但是前面的影响因素是一定要都考虑到的，否则谈论这个措施与否合用就有失偏颇了。在做过的许多余口产品的定量分析措施当中有许多是某些医药公司提供的比较完善而验证过的措施，内标与外标均有（她们用的都是自动进样）精密度都能满足SD不不小于1.5的规定，当一种措施可以满足测试规定的时候，
11、无论内标外标，都是可行的，固然有一种分析成本和分析时间的问题,内标的成本和控制溶液、样品溶液的配制固然要比外标要高和麻烦某些了。而有些时候，也许受你实验室既有仪器和附属设备的影响,达不到一定的规定，而还必须进行定量分析,有时外标的成果也许就要差某些,这时，你也许就要考虑用内标法了,可以排除手动进样的误差、分流歧视的影响、涉及某些未知因素平行误差的影响,这时内标也许就显示出它的优势来了。 2、上面已经提到当做措施验证的时候,当同同样品配制6个样品溶液用所选用的外标法进行定量的时候,RD都满足.%的规定期,也分为两种状况,不不小于1%和不小于1%不不小于1.5%。如果RSD的成果不不小于1，那这个
12、措施就没有什么可以怀疑的了;如果RSD的成果不小于而在1.5%略低某些的范畴活动时,这个措施的可行性就将受到质疑，毕竟这是措施验证,你就要考虑上面所提到的影响因素的影响了,如果排除掉以上的影响因素,RSD还是在.5%附近，就要尝试内标了,如果内标成果的S较好，就证明你的这个措施受实验条件的影响很大，只能用内标了，或者干脆将原措施做大的变动,再尝试用外标法测试。3、而对于微量分析,例如农药和兽药残留的分析、环境分析等，根据不同的限量原则规定对于精密度的规定也比常量分析的规定要宽松的多，RD有时可以容许达到10%甚至更高，这时也许外标法有更大的应用空间。 4、单从精密度方面去考虑，排除其他成本和效
13、率的因素,个人觉得还是内标优于外标。曾经做过一种中间体二氨基丙醇的常量定量分析，以二乙醇胺为内标，RTX5 min(碱改性）15m*0.3m*1.u色谱柱分析,将配制好的控制溶液(具有内标物)自动进样器进6针,目的物(二氨基丙醇)与内标物(二乙醇胺)峰面积比率的RSD为.18%，而只对这六针样品的目的物峰（二氨基丙醇)面积求R,成果为0.%,通过这一实例的成果人们就会发现究竟哪个措施精密度更好了,固然是内标更好了。固然这个化合物的检测措施最后根据上面的验证数据用内标和外标定量都是可以的，实验室可以自由选择。但内标与外标精密度成果的差别是显然存在的事实。 结论：应用外标法可以满足规定,首选还是外标法了,毕竟简朴而省事。对于精密度规定比较高、成果精确度会产生重大影响、实验室条件不是很抱负的等等条件下,用内标法还是必要的。无论应用那种措施,措施的验证和确认都是很重要的,只要是按照程序通过验证和确认的措施,均有其应用的空间的。
