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1、实时荧光定量PCR ( RT-qPCR )完全手册所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起 始模板定量及定性的分析。RT-qPCR是由三个步骤组成RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint) 关键词：荧光实时实时荧光定量PCRRT-qPCRRT-PCR反转录定量PCRQRT-PCR方法简介所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检 测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光 化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增
2、加。 每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的 变化，从而得到一条荧光扩增曲线。RT-qPCR是由三个步骤组成：1. 反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA;2. 扩增:用PCR的方法扩增cDNA;3. 检测:实时检测和定量扩增的产物.RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint):1. 分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计2. 反转录反应的非标准化影响试验的稳定性3. 数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此 通过对 RT-qPCR 的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大
3、化可重复性，而且还 需要沿用一个通用的数据分析的指南。对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分 析相适应的。Samp栢 typemRNATotal FtMspocmc primalRandom primers1Single targetkiurwPro-目mpi祁Hex*44owgo-cJT + HFPCR oof)ditionstranscriptasecDNA primiftgFigure 1 | StepsirrwoLwd in planrriig a ffT*jPCft assey. The numeroiis permutations illustrate the altern
4、atives and patentidl for rariabnlity associated with tlri$ techiriqueC4H 申诸innoitton： spudkntogrity:的曰 海却qFfl 海p spocrnc primasFITRnflwn pncii+n 训如 cor orsptfiiCfcpniiftSnpto sei 寓 ton, 2oKcUonr Btsi 即ibng 鸟 stocaghMcrodi&ctionLaser caplirQ rmroo日餐问rma sioru&i-BOcpTlnwr Corewlratkin opcma-aKw csybfi
5、 grnPrinwr pMtonna?io0 州 idation 谑畑RGro 骼 q询lidalio” Mas列 期幅押ncy ft snsiM时q?CR 升 viMsnon ana opbmcawxisamptoviKiaDon end pxpoirn 關口 i M或onv?vVf.bbioo.cofl?Figure 2 | RT-pCR ecTimentaL worWlow. The four inainlhenn&$ (assay valxhticn 百nd op曲mi甜tiom sample kin and data cntLection FT-PtR assay and data
6、ayialyas) are high lighted in different cdciSiCDOG9 脱 target d-iotea cf chsfinlstryPirinwf j and prote)可曲即矗nis儈 跑lewofl p皿釦 and日ptiir虫 的白鼎COimlnM Afr|PCR Stop 聊4CAC pjimn存在的问题由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以 及数据分析：1.新鲜、冰冻、甲醛固定的样品2.整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞3.总 RNA 或者 mRNA4. RNA反转录成cDNA的不同的引发策略5
7、. 不同的酶以及酶的不同组合6. 变异系数、灵敏度7. 多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。8. 每一步骤缺乏标准化分析流程造成了在样品的处理，内参的使用，归一化的方法，质量控 制等等因素严重影响RT-qPCR的可信度，重复性。RNA 质量评价现在 RNA 定量的程序很多。最近 EMBO qPCR course (http:/www-db.embl.de/jss/Embl GroupsOrg/c onf_28)比较了用 Ribogree n, Agile nt BioA nalyser, spectrophotometer,Na n odrop and the Bio
8、Rad Experion 来定量同样的样品。结果显示没有哪两种方法得到同样 的分析数据。所以用不同的方法进行定量是不明智的。因此，我们需要用统一套定量分析方 法来完成所有 RNA 样品的评价。RNA 质量RNA质量主要包括RNA的纯度（没有蛋白质和DNA的污染）以及完整性。传统的RNA 质量的评价通过分析A260/A280的比值或者对琼脂糖凝胶电泳rRNA的条带的分析。Agil ent Bioanalyser/BioRad Experion 微流体毛细电泳系统也是一种较新的分析方法。 Agilent 的2100也是一种十分好的分析RNA质量的方法，它通过分析18S以及28S rRNA的分析 图
9、谱，通过图谱来反应RNA的量和完整性，其完整性通过完整性系数（RIN）来反应。样 品的RINs在10-4之间。10代表完整的RNA，4代表没有完整的rRNA带。由于以上的方法并非100%准确定反应mRNA的完整性，因为他们只是反应rRNA的量来 间接测定mRNA的完整性。这里推荐一种方法：采用GAPDH的3： 5分析法。AVWlbiQQ.con）3GAP DM mRNAAAAAAA.1JD4 開 M 1,4X731,017 HEX DOCS3E Cy 429我们使用oligo dT进行逆转录，然后对逆转录的cDNA用multiplex荧光定量评价。设计三 个taqman探针来定量三种相同大小的
10、扩增产物。探针设计的位点分别位于35以及中部。 扩增产物的之间的比值反应RNA的完整性。如果35的比值在1,反应较高度完整性，如果 高于 5 说明降解。QRT-PCR 抑制物的组成QRT-PCR抑制物严重减少了 PCR的灵敏度以及热动力学反应，高度的抑制还导致假阴性的 结果。抑制物的来源：生物样品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，盐离子，尿素，血红素， hep arin 以及 IgG.是否有抑制物的评价体系：1通过对目的样品进行梯度稀释进行PCR扩增效率的检测2. 通过内部扩增对照来反应样品处理过程中样本的情况3. 用细菌基因组检测临床样品的抑制4. 通过标准人工合成的扩增进行 RT-PCR 来
11、反应目标检测物的抑制情况反转录反应系统1. RT 和 PCR 单一酶系统2. RT 和 PCR 分离的酶系统3. RNA 逆转录引物的选择引物主要有三种：1随机引物：随机引物，特别是6nt引物对所有的靶位点不产生十分稳定一致的结果，建议 使用15nt的随机引物.2.oligo-dT：只能用于mRNA完整的样品，特别有polyA .而且对于一些特殊的变异体以及较长的 3UTR 的区域比较困难3.特异引物：最特异最灵敏的方法。特别RNA量足够情况下建议使用此法。PCR 优化PCR 优化主要有：1.引物的浓度2建议使用SYBR Green I和EvaGreen进行扩增和溶解曲线的测试笔者建议的操作流
12、程:I.靶的选择和试验设计1.针对目的基因序列选择合适的扩增片断查看以下三个网站是否有合适的已经证实的QRT-PCR的扩增引物,探针以及反应条件.RTPrimerDB (http:/medgen.ugent.be/rtprimerdb)：PrimerBank (http:/pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html)Real Time PCR Primer Sets (http:/www.realtimeprimers.org)如果没有合适的或者已经证实的可以提供参考:以下的设计方案仅供参考：A. 最广泛使用的商业化的软件 Beacon Designer
13、(http:/)B. DIY 的软件 Primer ExpressC. 如果Beacon Designer无法得到您说需要的结果或者获得到设计方案的备选数目不够的话，可以选择 Sigma-Ge no sys http:/www.desig )的服务方案:详细周到D. 个免费的基于网页构架的引物和探针设计程序:http:/ s/probe_desig n.asp您可以挑选其中的4-6对引物进行试验,选择引物的扩增效率和灵敏度高的这个软件可以直 接与NCBI的网站进行比对,并且用NCBI的ePCR进行虚拟的电子PCR引物设计简介DNA 引物长度:15-25 个碱基GC 含量:50%左右如果引物的
14、与AT区域富集结合，可以考虑用LNA替换几个碱基，较少引物的长度以及避免引物次级结构和 3端二聚体的影响.由于引物和模板和探针与靶点之间的分之间的相互竞争, 分之内杂交,倒转重复等等会引起引物的引发探针对结合效率达降低,因此我们选择引物二 聚体的AG为负值，即:10 kcal/mol.没有连续的G/C.引物探针的保存一般遵循以下原则:正向和反向引物保存在-20度,浓度为10mM或者10xX作浓度探针应该避光保存，贮存 在-70 度，最好以冻干粉状态，工作浓度的液体保存一般两周左右。2. 输入靶序列，用 BLASTn 在 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast 进行比对3. 检查比对序列的多态性以及可能的错误避免这些区域来进行引物和探针设计4. 在靶序列中避免直接待重复区，在重复区进行杂交容易使得引物非获得产物性结合，降低 DNA 的扩增效率以及减少分析的灵敏度。5. 考虑到潜在的剪接变异体以及合适的所需要的获得到靶，通过生物信息学分析内含子以及 外显子的边界，主要通过CDNA和基因组序列比对来确定。一般都设计跨最长内含子区， 这样减少了扩增子受到基因组DNA的污染的影响。这是十分有必要的，特别当用基因组D NA 做归一化处理以及靶向某一特异的剪接变异体。最经济的做法是让下游引物跨越剪接接 头，这样允许使用一条探针检
