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1、精心整理方法一：1. 首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片）2. 然后在4%PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1%TX-100室温下作用1-2分钟使细胞膜通透。3. 接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。4. 剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1%BSA/TBS中的一抗（稀释倍数依具体抗体而 定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。5. 接下来二抗孵育步骤同上。6. 最后，在载玻片加上mounti
2、ngmedium （大约每个玻璃片加10ul ），把玻璃片放上去（细胞面朝 下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。7. 抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。8. 双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。如果 一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。方法二：1. 选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是 donkeyanti-rabbit-FITC （绿）和 donkeyanti-r
3、at-Tex-Red （红）。2. 我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。3. 我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是 .PBS+荧光标记物。4. 封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。5. 其余步骤同一般免疫荧光单标操作。方法三：1. 片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色2. 细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻 片用多聚赖氨
4、酸处理后让细胞自己爬片3. 细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。4. 其实小的well的话，可以直接拿来染色，没问题的。5. 固定：用PBS洗去培养液，用固定液（如甲醇和丙酮；4%多聚甲醛；酒精。）固定细胞。6. 内源性过氧化物酶处理，3%过氧化氢处理细胞（选作，二抗连HRP得必做，其他的如做免疫荧光染色不用做）。7. 通透(胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做；细胞膜蛋白不需要做)，一般选用Triton-X100来做细胞通透，浓度和时间需要摸索，一般是0.1-5%，处理时间为1-30分钟，级个别需要到1-2小时。8. 封闭：洗去通透液，用二抗同源的血清约10%的浓度inPBS中封闭半小时，也
5、可以选用5-10%脱脂奶粉。封闭结束后千万不要洗，直接上一抗。9. 一抗：具体你想做什么样的蛋白，咨询抗体公司如santacruze,Abcam,sigma.o选取具体的抗体，但是一抗的稀释浓度也是要摸索，抗体稀释液可以购买抗体公司现成的，对于新手还是挺好的。 时间一般是4度过夜或者37度1小时。一抗最好还是选用外国抗体公司的抗体。10. 洗去一抗。11. 上二抗，二抗一般抗体公司会给你推荐的，你在其中选上一个就行了，自己选国产的也行，就 是选在哪个动物体内做的一抗，二抗就选抗那个动物的就行了。二抗的浓度也是需要摸索的，抗体稀释液和一抗相同就行了。二抗的时间一般是37度半小时。12. 底物显色
6、(选作，二抗连得是酶的必做，按试剂盒的说明书添加就行了，显色时间可能需要摸索，以免显色过度引起假阳性；二抗连得是荧光报告的不用做)13. 洗去二抗，染核14. DAPI 或者 Hoechst 染核15. 洗去染核液，加PBS，上镜观察。方法四：(1)细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm，5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4C保
7、 存3个月。PBS洗涤3x5min。 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处 理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在 5-15mino 通透后用PBS洗涤3x5min。(4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30mino(5) 一抗结合。室温孵育1h或者4C过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min。(6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1ho PBST漂洗3次，每次冲洗5min后， 再用蒸馏水漂洗一次。(7) 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。方法五：1 .
8、漂洗血清蛋白PH7.2-7.4 , 37度PBS2小时.2 . -20度甲醇固定20分钟后，自然、干燥10分钟3 PBS 洗净：3min * 3精心整理4 . 1%Triton : 25min-30min.配成 50ultriton+5mlpBS5 . PBS 洗净：2 * 5min6 .羊血清封闭：37度，20分钟7 . 一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度1-2小时8 . 4 度 PBS 洗净，3 min * 5 次9 .二抗37度小于一小时10 .37 度 PBS 洗净，3 * 3min11.凉干封片（封闭液PH8.5 ）细胞免疫荧光步骤：1.细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖
9、玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗衣粉洗 干净，用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱 中大约8小时烤干备用。爬片可以在培养皿六孔板或24孔板中都可，我选择在培养皿中爬。一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比较方便。培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镶子？具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将 来爬出来片子的质量）取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。最后盖上培养皿置于37度5%CO2的暖
10、箱中培养， 根据细胞生长状况，24小时或更长时间适时取出爬片。爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4%多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在-20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。2.4%多聚甲醛固定10min（固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮）；精心整理3.PBS 漂洗 5min ;
11、4.0.5%Triton穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)；5.PBS漂洗2次，每次5min ;6.1%BSA 封闭 30min ;7.加入1%BSA稀释的一抗，于37C杂交2h ;8.PBS漂洗2次，每次5min ；9. 加入1%BSA稀释的二抗，于37C杂交1h ；10. PBS漂洗2次，每次5min ；11.5ug/mlDAPI 染色 2min ；12.抗淬灭封片剂封片。抗淬灭封片剂：2.5%DABCO(w/v)50mMTris(pH8.0)90%甘油细胞免疫荧光细胞爬片4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)PBS 漂洗 5min0.5%Triton 穿孔 15min(丙酮固定法不用透化处理)PBS漂洗2次，每次5min1%BSA 封闭 30min加入1%BSA稀释的一抗，于37C杂交2hPBS漂洗2次，每次5min加入1%BSA稀释的二抗，于37C杂交1hPBS漂洗2次，每次5min5ug/mlDAPI 染色 2min抗淬灭封片剂封片2.5%DABCO(w/v)抗淬灭封片剂50mMTris(pH8.0)90%甘油0.25gDABCO9ml甘油0.5ml1MTris(Ph8.0)70C 溶解，-20C保存0.5mlddH2O
