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1、一外周血淋巴细胞RNA提取1. 外周血淋巴细胞分离提取:10ml 人外周血血样(EDTA-2K抗凝管采集)稀释血样:DHanks 以1:1稀释加入淋巴细胞分离液(稀释血样:淋巴细胞分离液=2:1)室温,2000rpm/min 离心20min吸取单个核细胞层DHanks洗涤细胞1500 rpm/min 离心10minDHanks洗涤细胞1000 rpm/min 离心10min收集淋巴细胞沉淀(细胞计数:约1107个细胞)2. 外周血淋巴细胞RNA提取: 1107个淋巴细胞中加入1ml TriZol,4静置5min,裂解 加入200ul氯仿,上下颠倒至溶液出现浆白色,无分相现象 置于冰上5min;
2、4,12000rpm/min,离心15 min将上层水相移入另一离心管,加等体积异丙醇,冰上孵育10min 4,12000rpm/min,离心10 min 弃上清,在沉淀(含RNA)中加1ml 75%乙醇洗涤 4,12000 rpm/min,离心5 min,得到RNA沉淀;空气干燥后,用适量TE或无RNase水溶解备用RNA浓度:1400g/l,OD260/OD280=2.00淋巴细胞分离液:上海华精生物高科技有限公司标准号:Q/GHSB 85-2001 批号:040524二1st-Strand cDNA合成反应:1. 在Microtube中配制下列混合液试剂使用量Oligo dT Prime
3、r (50M)1ldNTP Mixture (10mM each)1l模板RNA Total RNA:5g以下(4l)RNase Free dH2OUp to 10l2. 65保温5min后,冰上迅速冷却。3. 在上述Microtube中配制下列反转录反应液,总量为20l。试剂使用量上述变性后反应液10l5PrimerScript Buffer4lRNase Inhibitor (40U/l)0.5l (20U)PrimerScript RTase (200U/l)1l (200U)RNase Free dH2OUp to 20l4. 缓慢混匀。5. 按下列条件进行反转录反应:42 30-60min,95 5min,冰上冷却。以PET28a为载体表达产物N端带有可以被thrombin酶切的组氨酸标签,上游primer:5-GGAATTCCATATGACCTGCTGCAGTCTACAC -3 (Nde I酶切位点以及保护碱基)下游primer:5-CCGCTCGAGTTAAAATTTTAATAGCTAGTCTTCG-3(Xho I酶切位点以及终止密码子、保护碱基)