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1、1、B细胞表位预测对于多种免疫学研究是必不可少的。针对不同的蛋白，应选择不同的方法。一般来说，蛋白质的C端具有较好的亲水性、表面可及性和柔性，所以是很好的抗原决定簇区域。本课题选用的蛋白质C一末端序列标签都是唯一的、或是其家族中的几个成员所共有的.在人蛋白质中，约81%的蛋白质其C末端的5个氨基酸残基的小肽是该蛋白质所特有的，制备针对蛋白质C末端小肽的抗体，常常能得到特异性识别该全蛋白的抗体。另外，蛋白的二级结构是B细胞表位计算机预测的重要参数之一，3转角为凸出结构，多出现在蛋白质抗原表面，有利于与抗体结合，较可能成为抗原表位.而a螺旋和3折叠结构规则不易变形，较难结合抗体，一般不作为抗原表位
2、.含有5个以上的氨基酸残基的转角又常称为环(loop)。以往的研究表明，蛋白表面的loop区可能为功能性抗体的识别位点，特异性好，可及性强。本课题选用的HPO、G-CSF、HSA空间结构已明确，所以直接选择loop区或无规卷曲作为B细胞表位.举例：人Pif1基因编码至少两种蛋白亚型，分子量分别为74kDa和80kDa,与酵母具有高度的同源性，口型和3型Pif1只有C末端不同20,其余部分完全相同，并且二者的C末端在蛋白数据库中都是唯一的，选择a型和3型白C末端作为B细胞表位，既满足特异性的需要，也能区分亚型口GPAA1是一种跨膜蛋白，原核表达非常困难，形成包涵体，且包涵体难以溶解和复性。对这一
3、类型的蛋白，非常适合选择其特有的B细胞表位免疫动物，来最终制备识别全蛋白质的抗体。ABCpred是基于人工神经网络模型的线性B细胞表位预测工具，该系统检验了源于Bcipep数据库的700个非冗余B细胞表位和源于SwissProt数据库的700个长度为1020个氨基酸的随机选择多肽，准确率近66%。Bepipred结合隐马尔科夫模型和亲水性参数评分预测线性B细胞表位，AROC评分达到0.671。将两种预测方法得到的预测结果进行比较，其共有的预测表位是真正B细胞表位的几率更大，如果能进一步结合蛋白质二级结构预测结果，就可以选出可信度更高的B细胞表位。如何选择有效的B细胞表位是能否实现无完整蛋白质抗
4、原条件下抗体制备的关键2、对于B细胞表位的选择，对于已有空间结构信息的蛋白质抗原，直接选择蛋白分子表面的loop区或无规卷曲区域的小肽序列作为候选B细胞表位；对于缺乏空间结构信息的蛋白质抗原，需要根据蛋白质抗原的特点具体分析.若蛋白质抗原C末端的序列亲水性好，可以选择C末端的610个氨基酸的序列作为候选B细胞表位，并且最好该序列为该蛋白质所特有；也可采用B细胞表位预测程序进行分析，选择不同程序预测的共有B细胞表位；对于同源性很高的家族蛋白，根据序列比对结果选择差异较大的区域，并且所选序列应该符合B细胞表位的特征。基于以上原则，本实验选择了10个蛋白的14个表位，并对其中的12个表位进行了验证。
5、3、对于B细胞表位的选择，(1)对于空间结构已知的蛋白质，直接选择蛋白分子表面的loop区或无规卷曲区域的小肽序列。(2)对于空间结构未知的蛋白质，可采用以下策略进行选择：二|A:若蛋白质C末端序列的亲水性好，可以选择C末端的610氨基酸的序列作为候选B细胞表位，最好该序列为该蛋白质所特有。可采用SIBBLASTNetworkService(http：/www。expasy.ch/tools/blast/)的BLAST软件进彳f比对，数据库选择homosapiens;B:采用B细胞表位预测程序ABCpred和BepiPred等进行表位预测，选择不同程序预测的共有B细胞表位；C:对于同源性很高的
6、蛋白质，首先根据序列比对结果选择差异较大的区段，并且所选序列应该符合B细胞表位的特征4、二级结构预测分别应用EXPASY服务器(http:/www.expasy。org/tools)上的GOR44卜HNN(HierarchicalNeuralNetworkmethod)、SOPMA、nnPredictUniversityofCaliforniaatSanFrancisco(UCSF)等方法。亲水性、柔韧性、表面可能性和抗原表位预测应用DNAstar软件的子程序Protean,采用Hopp-Woods和KyteDoolittle方案预测氨基酸的亲水性15,6,采用Karplus-Schultz和
7、Emini方案预测柔韧性及表面可能性7,8,采用Jameson-Wolf方案9和吴氏抗原指数法10预测潜在的B细胞抗原表位5、对获取序列的生物信息学处理分析使用DNASTAR软件分析获取的序列，结合NCBI上的BLAST寻找最匹配的短序列。用全部和部分肽序列查询各国专利数据库：http:/appft1。uspto.gov/netahtml/PTO/searchadv.ht/http:/www。freepatentsonline。com/5194592。htm/http:/www.stcsm.gov。cn/resource/data/zhuanl.iasp#1使用蛋白质在线分析工具分析多肽的疏水
8、性、PI值、稳定性：:http:/www。expasy.org/http:/www。rcsb。org/pdb/cgi/explore.cg?ipdbId=1fi6http:/www。rcsb。org/pdb/search/searchSequence。dohttp:/www.expasy。org/sitemap。htmlhttp:/www。expasy。org/tools/#translatehttp:/www。expasy。org/tools/blast/常用数据库和预测工具：名称网址说明ABCpredhttp:/www.imtech.res。in/raghava/abcpred人工神经网络
9、线性B细胞表位预测工具AgAbDbhttp:/202。41。70.51:8080/agabdb2/抗原-抗体共结晶结构的分子相互作用数据库AntiJenhttp:/www.jenner.ac。uk/AntiJenB细胞表位定量结合数据库Bcipephttp:/www。imtech。res.in/raghava/bcipep/B2田胞表位数据库Bepipredhttp:/www.cbs。dtu.dk/services/BepiPred基于序列的线性表位预测工具CEPhttp:/bioinfo.ernet。in/cep。htm基于结构的连续性和非连续性表位预测工具DiscoTopehttp:/ww
10、w。cbs。dtu。dk/services/DiscoTope基于序列/结构的非连续性表位预测工具Epitomehttp:/www.rostlab.org/services/epitome抗原-抗体相互作用残基数据库HIVdatabasehttp:/www.hiv。lanl.gov/content/immunologyHIV免疫表位数据库IEDBhttp:/www.immuneepitope。orgT细胞和B细胞表位数据库含阴性数据IEDBBcellhttp:/wwwoimmuneepitope.org/tools/bcell/iedbinput基于序列的线性表位预测工具epitopetool
11、s6、B细胞表位预测的方法及应用线性表位的预测方法B细胞表位的预测方法主要集中于线性表位，在二十世纪七、八十年代发展起来的大量的预测B细胞表位的算法都是基于蛋白质序列。这些算法包括：蛋白质的亲水性算法(Hydrophilicity):认为蛋白质各氨基酸残基可分为亲水残基和疏水残基两类。在机体内，疏水性残基一般被埋在蛋白内部，而亲水性残基位于蛋白质表面，因此，蛋白的亲水部位与蛋白抗原表位有着密切的联系。Hopp-Woods(HoopTPetal。，1981)算法为最常用的。可及性算法(Accessibility):常用的有Janin可及性参数，即指蛋白质抗原中氨基酸残基被溶剂分子接触的可能性(R
12、udolphRetal。/990).它反映了蛋白质抗原各个氨基酸残基的分布情况.蛋白质可塑性算法(Flexibility)：此算法认为蛋白质抗原构象的多肽链骨架具有一定程度的活动性，活动性强的氨基酸残基即可塑性大，易形成抗原表位(KarplusPAetal。，1985)。蛋白质二级结构预测算法(Secondarystructure):该算法认为蛋白质二级结构与蛋白质表位的分布关系密切。“螺旋、3折叠化学键键能比较高，形态固定，常处于蛋白质内部，难以与抗体嵌合，而3转角和无规则卷曲多处于蛋白质的表面，结构松散，易展示在蛋白质表面，有利于与抗体嵌合，成为抗原表位的可能性大(来鲁华，1993)。蛋白
13、质抗原性算法(Antigenicity):Welling(WellingGW。，1985)通过对20个已研究得很透的蛋白质的69个连续位点的606个氨基酸统计分析，用各氨基酸残基在已知B细胞表位中出现的百分率与其通常在蛋白质中出现的百分率比值的对数建立了抗原性刻度，并以此计算蛋白中各亚序列的抗原性。这些方法的代表软件有PEOPLE(AlixAJetal.,1999)、PREDITOP(PellequerJLetal.,1993)、BEPITOPE(OdoricoMetal.,2003)、Bcepred(SahaSetal。,2004)等.但是最近Blythe及Flower(BlytheMJet
14、al.,2005)对氨基酸的性质与线性表位的关系做了一个评估，结果表明基于氨基酸序列信息来预测线性表位，即使很好的结合了氨基酸的各种性质，其预测结果仅略强于随机预测。近年来，一些应用隐形马尔可夫模型(HMM)、人工神经网络(ANN)、支持向量机算法(SVM)及其他技术的机器研究方法(PonomarenkoJVetal。，2007)已经被引入来预测B细胞表位，取得了较好的结果。代表软件有ABCpred(SahaSetal。,2006)、BepiPred(LarsenJEetal。,2006)、APP(ChenJetal.,2007)等.ABCpred采用人工神经网络来预测线性表位，从Bcipep
15、和SwissProt数据库中提取非冗余的表位肽和非表位肽作为训练集，采用5一折交叉验证，预测敏感性约为67%,特异性约为64%。BepiPred结合氨基酸的性质(亲水性、柔韧性、可及性、极性、暴露表面、转角)和隐形马尔可夫模型来预测线性表位，预测结果表明，同那些仅依赖于氨基酸性质的预测方法相比，BepiPred预测结果的准确性有一定程度的提高。Chenetal。(2007)发现氨基酸通常成对出现在抗原表位的频率要比其出现在非表位肽段的频率高，基于此，并联合支持向量机算法建立了APP方法。应用此方法在872个表位肽和872个非表位肽数据集中，采用5一折交叉验证，预测准确度为71%。YasserELManzalawy(ELManzalawy丫etal.,2008)等采用同一数据集对这三种方法进行比较，结果表明ABCpred预测表位的准确性略高于BepiPred及APP.构象表位的预测方法目前，绝大多数B细胞表位预测方法都是基于蛋白质的一级或二级结构的，但这些方法只能用来预测由连续的氨基酸残基构成的线性表位，而基于蛋白质的三级结构来预测构象表位的方法比较少，这是因为各种抗原的构象表位可获得的数据要远远少于线性表位，并且到目前为止，几乎没有哪个抗原的所有的表位都能够彻底的研究清楚(HasteAndersenPetal。，2006)。基于蛋白质三级结
