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1、第二章酶学基础一、酶的活性中心（active center, active site）（一）活性中心和必需基团1、与酶活性显示有关的，具有结合和催化底物形成产物的空间区域， 叫酶的活性中心，又叫活性部位。2、活性中心可分为结合部位和催化部位。3、结合部位决定酶的专一性，催化部位决定酶所催化反应的性质。才14中心rJEXilPl TI傕化沛叵音恨中心汁的止主HFI活性中心外的必菁基团与难膂整个奇分 子的空间构象有关4、酶结构概述（1）活性中心是一个三维实体。（2）是有一些一级结构上可能相距较远的氨基酸侧链基团组成，有 的还包含辅酶或辅基的某一部分基团。（3）在酶分子表面呈裂缝状。（4）酶活性中心
2、的催化位点和结合位点可以不止一个。（5）酶活性中心的基团都是必需基团，但必需基团还包括活性中心 以外的基团。5、酶分子中的氨基酸残基或其侧链基团可以分为四类1. 接触残基2.辅助残基3.结构残基4.非贡献残基（二）酶活性中心中的化学基团的鉴别1. 非特异性共价修饰：某些化学试剂能使蛋白质中氨基酸残基的侧链基团反应引起共价结 合、氧化或还原修饰反应，使基团结构和性质发生变化。如果某基团修饰后不引起酶活力的变化就可初步认为此基团可能是 非必需基团；反之，如修饰后引起酶活力的降低或丧失则此基团可 能是酶的必需基团。2. 亲和标记共价修饰剂是底物的类似物，可专一性地引入酶的活性中心，并具 有活泼的化学
3、基团（如卤素），可与活性中心的基团形成稳定的共价键。 因其作用机制是利用酶对底物类似物的亲和性而将酶共价标记的，故 称为亲和标记。3. 差别标记在过量底物或可逆抑制剂遮蔽活性中心的情况下，加入共价修饰剂， 使后者只修饰活性中心以外的有关基团；然后去除底物或可逆抑制 剂，暴露活性中心，再用同位素标记的向一修饰剂作用于活性中心的 同类基团；将酶水解后分离带有同位素的氯基酸，即可确定该氨基酸 参与活性中心。4. 蛋白质工程这是研究酶必需基闭和活性中心的最先进方法，即将酶蛋白相应的 互补DNA（cDNA）定点突变，此突变的cDNA表达出只有一个或几个 氨基酸被置换的酶蛋白，再测定其活性，可以知道被置换
4、的氨基酸是 否为活力所必需。优点：改变酶蛋白中任一氨基酸而不影响其他同类残基改变疏水残基，使其转变成亲水或另一疏水残基同时改变活性中心内外的几个氨基酸个或多个氨基酸的缺乏或插入改变酶蛋白的磷酸化位点或糖化位点不致引起立体障碍（三）组成活性中心的重要化学基团丝氨酸、组氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和 赖氨酸二、酶的结构和功能的关系（一）酶的一级结构与催化功能的关系酶的一级结构是酶的基本化学结构，是催化功能的基础。（二）酶的二级和三级结构与催化功能的关系酶的二级、三级结构是所有酶都必须具备的空间构型。维持酶的活性 部位所必须的酶蛋白的二级和三级结构彻底改变，就会使酶遭受破坏 而丧
5、失其催化功能，这是蛋白质变性的依据。1 .酶的变性和失活2 .活性中心的挠性3 .酶分子的结构域（三）酶的四级结构与催化功能的关系具有四级结构的酶，按其功能可分为两类，一类与催化作用有关，另 一类与代谢调节关系密切。三、酶催化作用的基本理论（一）酶一底物复合物1 .酶一底物复合物存在的证据1903年，Henri用蔗糖水解酶水解蔗糖提出的。E+S= ES= P+ E（S： substrate， P: product）在反应过程中，酶首先与底物形成酶-底物中间复合物（ES, enzyme-substrate intermediates）,再分解成酶（E）和产物（P），使反 应沿一个低活化能的途径进
6、行，降低反应所需活化能。2. 酶与底物形成复合物的作用力1）离子键2）氢键3）范德华力（二）酶作用的专一性机制1. 锁钥学说（lock and key theory）2. 诱导契合学说（induced-fit hypothesis）（三）酶作用的高效性机制1. S 与 E 的靠近效应和定向效应 proximity and orientation靠近效应：指两个反应的分子，它们反应的基团需要互相靠近， 才能反应。2. 酸碱催化（acid or base catalysis）酸碱催化是通过瞬时地向反应物提供质子或从反应物接受质子以稳 定过渡态、加速反应的一类催化机制。由于E活性中心含有酸碱基团，
7、它们可以与S中的酸碱基团进行质子交换，加强了 E与S的相互作用， 减弱了S分子内部的化学键，使S由稳态一不稳态狭义酸碱催化（specific acid-base catalysis）: H+和 OH广义酸碱催化（general acid-base catalysis）：质子供体和质子受体3. 共价催化（covalent catalysis）（1）共价催化又称亲核催化（nucleophilic catalysis）或亲电子 催化（electrophilic catalysis）（2） 亲核攻击集团：-OH，-SH，-N （咪唑基）（3）底物亲电中心:磷酰基（P=O）酰基（C=O）糖基（Glu-C
8、-OH）底物中典型的亲电中心为折基.酰基?喉基4.金属离子催化5.多元催化6.微环境的影响注：活性中心可以避免水分子的干扰（在避开水分子的干扰后，分子 间的离子键才容易产生）7.底物的变形（distortion）与张力作用（tensility）四、影响酶促反应速度的因素1. 底物浓度对酶反应速度的影响随着底物的增加，反应速率西先是符合一级反应，再到混合级反应， 最后当底物增加到一定浓度是达到最大反应速度，此时为零级反应。2. 酶浓度的影响（1）底物充足时，反应速度随酶浓度的增加而增加，反应速度与酶 浓度成正比（2）底物浓度不足时，起初反应速度与酶浓度成正比。（3）底物中有不可逆抑制物存在时，反
9、应速率先成正比，当酶浓度 达到一定是反应速率不会成正比（4）酶液中有可逆抑制剂存在时，反应速率最酶增加而增加，但是 不符合正比，并且最初的反应速率变化最小。3. 温度的影响：随温度增加反应速率先增加后减小4. pH的影响随pH增加反应速率先增加后减小pH影响的机理：1）pH影响E活性中心及附近有关基团的解离，使之易或不易与S 结合；2） pH影响S的极性基团，从而影响这些基团与E的结合;3）过酸、过碱可使酶变性失活。9激活湖口抑制削-凡能增高酶活性的物成称为曲的激活剂凡能降低或】响1曲沽盹并不快曜部性的物质称为 璃的抑制布I-1）醯的激活剂（金届篱了； K+、Na+、匚档、购村、Zn?等* 无
10、机窝子 _兀桐明寤子；Q篝。我窝子巾等太小的有机分上.某些还原制；G#l、Cys 全国翠含剖歪白届由ML* 由中妙W2）酶的抑制剂抑制作用与抑制剂（inhibition and inhibitor）:酶分子中的必需基团的 性质受到某种化学物质的影响而改变，导致酶活性的降低，甚至丧失， 但并未引起酶变性的作用称抑制作用。可逆抑制（Reversible Inhibition）通常以非共价键与酶和（或）酶-底物复合物可逆性结合，使酶活 性降低或消失。采用透析或超滤等物理方法可将抑制剂除去，使酶恢 复活性。类型：竞争性抑制（competitive inhibition）非竞争抑制（noncompeti
11、tive inhibition）克孚忤抑能J不可逆瞬!1作用（irrnersible inhibirion）枷*怯I以共仙整和南外子1必爰忘团结合（牢固结合， 使峋沽性峰做更丧火，讴钟仰制曲不祗ifliSIfr、起建寺物理 方法偶晾抑制作用，专一牲的不可徘41制不可瓯抑制-I非*一性倘不可通抑制第二节酶在生物体内的几种存在方式一、单体酶、寡聚酶、多酶复合体1. 酶蛋白是一条具有三级结构的多肽链，相对分子量为13000-35000， 不能再解离成更小的组成单位2. 寡聚酶具有四级结构，是由两个或两个以上的亚基组成的酶，这些 亚基可以是相同的，也可以是不同的3. 多酶复合体多酶复合体是指几个酶联合
12、而成的络合物，其中酶以非共价键彼此嵌 合在一起。一般由26个功能相关的酶组成，这样更有利于生化反 应的连续进行，以提高酶的催化效率，同时也便于机体对酶的调控。1）多酶复合体组成成分的结合强度可能差别很大2）在催化活性上没有直接相关的酶也可以组成多酶复合体3）在细胞内各种多酶复合物还可能通过和细胞膜或细胞器结合在一起。从而通过相互邻近组成高效的物质和能量代谢系统。二、同工酶同工酶具有多种生物学功能：1）同工酶作为遗传标志已广泛被遗传学家用于遗传分析的研究。2）同工酶和个体发育及组织分化密切相关3）同工酶与代谢调节4）同工酶与癌基因的表达5）同工酶分析法在农业上已开始用于优势杂交组合的预测6）临床
13、上可作为疾病的诊断指标。三、别构酶和修饰酶1. 别构酶（allesteric enzyme）概念：具有别构调节作用的酶称作别构酶。许多寡聚酶具有调节亚基，催化亚基只结合底物，调节亚基结合 调节剂，因此称别构酶，是调节代谢的重要酶。2. 修饰酶1 .修饰酶的类型2.修饰酶的特点绝大多数修饰酶具有无活性/有活性（或低活性/高活性）两种形式（2）耗能少（3）效率高四、结构酶和诱导酶心酶和麴!定一、酶活力单位酶活力（enzyme activity,也称酶活性）:酶催化反应的能力，酶活力 用在一定条件下，它所催化的某一化学反应的反应速度来表示。酶的活力单位（IU, active unit）1IU：指在最
14、适反应条件下，1分钟内催化1 mol底物转化为 产物所需的酶量。酶的比活力（specific activity）指每mg蛋白质所具有的酶活力，一般用U/mg蛋白质来表示。二、酶活力的测定方法酶活力测定时条件的选择：1. 选择合适的化学反应及检测指标2.底物浓度的选择3.其他条件 的选择（pH，温度，缓冲液，辅助因子或辅酶，激活剂，抑制剂）度铢，电化学 u=如果明院&应的产物其有咒诃见 A 、紫外祝 暇收I*所，或耳俑产 伽讲行一生反回后旦白井B31&H庙方便，京用“hi祯射性曰怖寿牝记讷底哲祖ffttl 宙氏由，更片古伽的只佬若昧帅前* 灵畋雎吕，出不宰用“反佑讨程巾有网的至化，plllHIp
15、H讦榆暗，mElffiffis法刑I定方便，坪 Of LJb fiMBi三、酶的纯度鉴定酶产品质量评价中常使用其活力。判断分离纯化方法的优劣，通常用两个指标来衡量:总活力的回收：表示提纯过程中酶的损失情况比活力的提高的倍数：表示提纯方法的有效性 得率和纯化倍数的计算：总活力=活力单位数/mL酶液X总体积（mL） 比活力=总活力/总蛋白（mg）得率=每步骤的总活力/第一步的总活力以百分比表示，第一步的得率为100%纯化倍数=每步骤的比活力/第一步的比活力 起始的纯化倍数为12.稳态前在任何一个酶反应系统中，酶和底物一经混合，就会立即生成酶一 底物络合物(ES)及产物(P)，并随时间而逐渐升高。但经过一定时间后， ES的形成与分解达到动态平衡，而P也将以恒定速度生成，系统进 人稳态。但是
