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1、土壤中高产淀粉酶菌株的筛选方案：一、实验材料 样品:四川化工职业技术学院采集的土样若干 试剂:营养琼脂、淀粉 、土壤、碘液等 仪器：高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱 .移液管、培养皿、试管、三角瓶、量筒、酒 精灯、接种环等 液体培养基:淀粉10 g、硫酸铵10 g、氯化钠5 g、硫酸0.5 g、 磷酸氢二钾1 g、牛肉膏1 g,定容1 L二. 实验步骤（一）培养基的配置1. 称量 按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。 牛肉膏常用玻棒挑取,放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶化后倒入烧杯。2. 溶化 在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量,用玻棒搅匀,然后,在石棉 网上加热使
2、其溶解。待药品完全溶解后,补充水分到所需的总体积。将称好的琼 脂放入已溶化的药品中,再加热溶化,在琼脂溶化的过程中,应控制火力并需不 断搅拌,以防琼脂糊底烧焦。3. 分装 将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。 分装过程中注意不要使 培养基沾在管口或瓶口上,以免沾污棉塞而引起污染。 固体分装分装试管,其 装量不超过管高的 1/5,灭菌后制成斜面,分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶 容积的一半为宜。4加塞 培养基分装完毕后,在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞,以阻止外界 微生物进入培养基内而造成污染。5. 包扎 加塞后,将全部试管和三角瓶用麻绳捆扎好,再在棉塞外包一层报纸, 以防止灭菌时冷凝水润湿棉
3、塞,其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名 称、组别、日期。培养皿、移液管、涂布棒用报纸包扎好。试管里面加入45ml 自来水，三角瓶里面加入90ml自来水和玻璃珠，加塞，包扎。6. 灭菌 将上述培养基及其仪器121. 3C, 20分钟高压蒸汽灭菌。7搁置斜面及倒平板 将灭菌的试管培养基冷至50C左右（以防斜面上冷却水 太多），将试管口一端搁置在书边上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半 为宜。三角烧瓶里的培养基在超净工作台上倒平板，然后静止，待其凝固（二）产淀粉酶菌株的分离、纯化1. 土样的采集（1）地点的选取：四川化工职业技术学院花园 （潮湿） （2） 采集时 间:2013-9-5 8
4、:00 （3）采集原则：地点选取后，用小铲子出去5cm表土，取离 地面5-20cm处的土，盛与袋中并标明时间，地点及环境情况。2. 菌悬液的制备和梯度稀释（1）取10g 土壤样品加入90ml无菌水中并放于震荡培养箱中培养20分钟，然 后在水浴锅中放置 30 分钟，取出待冷却至室温。（2）取六只试管编号16分别加入9ml无菌水，从菌悬液中取1ml上清液加 入1号管后震荡摇匀，然后再从1号管中取1ml加入2号管震荡摇匀，依次操作 六个试管，得到10_110_6六个稀释度的菌悬液。3. 涂布平板法分离产淀粉酶细菌 （1）倒平板：将配置好并已灭菌的淀粉培养基倒入培养皿中（大约 10-15ml）涂布：取
5、0.2ml稀释度为10 3菌悬液倒入平皿，用涂布棒涂匀，标记后倒扣 放入恒温培养箱37 C恒温培养24小时。依次对10一4、10一5、10一6三稀释度 的菌悬液进行上述操作。（3）培养 24 小时后取出培养皿，然后加入少量碘液，观察其透明圈的大小。4. 平板划线法纯化菌株（1）将上述已分离好的产淀粉酶菌株划线纯化（挑取透明圈比较大的菌株）（2）重复上述操作 2-3 次，直至出现单菌落 。（ 三） ; 鉴定选择单菌落进行制片,革兰氏染色观察其形态,保存单菌落。（四）.高活力淀粉酶菌株的筛选1 、将斜面上保存的菌种活化后制成1 0-6菌悬液。2、配置液体培养基：取淀粉10 g、硫酸铵10 g、氯化
6、钠5 g、硫酸亚铁0.5 g、磷 酸氢二钾1 g、牛肉膏1 g,加水溶解定容至1L。将培养基在121. 3C,高压蒸 汽灭菌 20min。3、将制好的菌悬液按体积分数 4的接种量接种于装有液体培养基的摇瓶中， 编号，摇瓶容量250 mL,装量50 mL,培养温度37C，摇床转速180 r / min, 培养24h。种子液做镜检观察。4、培养好的液体4000 r / min离心20min,取上清液0.2 mL与1 mL质量分数1 % 的淀粉溶液于37 C水浴5 min,然后沸水浴5 min,终止反应，再加入1 ml碘液, 沸水浴 5 min 后，迅速冷却观察颜色。以空白液体培养基加质量分数 1%淀粉直 接煮沸再加1 ml碘液，反应后作为空白对照。（五）:实验预期结果： 终止反应后观察到的颜色,如果颜色越淡则表示该菌株的产淀粉酶酶活较高,反之则比较底。在点样法中,得到的比值越大说明产淀粉酶活性越高,反之则比较 低.。在观察颜色和测量直径是存在误差,结果应采取更精确的方法。（六）:注意事项：1. 液体培养基做好后应该立即灭菌,防止空气或别的杂菌污染培养基。2. 无菌操作时一定严格遵守各步操作步骤 ,以防被污染.3. 沸水浴后要迅速冷却。
