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1、CP(2015版)1143EP(8.0)2.6.14USP(36)85JP(16)6.06定义CP(2015)本法系利用窗试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌.内素素EP(8.0)本法利用赏试剂（从美洲童或中华赏一一阿米巴细胞溶解产物制备而来）检测由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素或对内毒素进行定量USP(36)检查和定量供试品内毒素的方法。本法利用邕（美洲童或中华赏）阿米巴细胞溶解产物制备的用于内毒素检测的赏试剂（LAL）检定内毒素JP(16)本法利用赏试剂（从美洲童或中华赏一一阿米巴细胞溶解产物制备而来）检测由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素或对内毒素进行定量方法CP(2015)一、凝胶法二、光
2、度测定法1、浊度法2、显色基质法EP(8.0)方法A:凝胶法：限度试验方法B:凝胶法：定量试验方法C:动态浊度法方法D:终点显色法方法F:终点浊度法USP(36)一、凝胶法二、光度测定法1、浊度法2、显色法JP(16)一、凝胶法二、光度测定法1、浊度法2、显色法仪器CP(2015)干热灭菌法（250C,30分钟以上），塑料器具应无内毒素并且对试验无干扰EP(8.0):干热灭菌法（250C,30分钟以上），塑料器具应无内毒素并且对试验无干扰USP(36)干热灭菌法（250C,30分钟以上），塑料器具应无内毒素并且对试验无干扰JP(16)干热灭菌法（250C,30分钟以上），塑料器具应无内毒素并且
3、对试验无干扰溶液制备CP(2015)供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和赏试剂混合后溶液的pH值在6.0-8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌.内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。EP(8.0)内毒素储备标准溶液的制备用内毒素标准品制备内毒素储备标准溶液；所用的内毒素标准品必须先用国际标准品校准，如内毒素标准BRRUSP(36)JP(16)内毒素以国际单位（IU）表示。IU的换算见国际卫生组织公布的国际标
4、准。注：一国际单位（IU）内毒素相当于一个内毒素单位（E.U.）。根据包装说明书上的标准和内毒素储备标准溶液的标签上关于制备和贮存的说明。内毒素标准溶液的制备充分混合内毒素储备标准溶液后，用细菌内毒素试验检查用水（BET检查用水）稀释，制成适当的系列稀释液，即得BET检查用内毒素标准溶液。得到的稀释液应尽快使用，以免因吸附而导致活性损失。供试品溶液的制备除非另有说明，以BET检查用水溶解或稀释活性成分或药品来制备供试品溶液。某些成分或药品可能在其它的水溶液中溶解度更高。如有必要，调节待测溶液（或它的稀释液）的pH值，使赏试剂和供试品溶液的混合物的pH值在所选赏试剂生产商的指定pH范围内。一般要
5、求供试品溶液的pH值范围为6.0-8.0。可用赏试剂生产商推荐的酸、碱或适当的缓冲溶液来调解pH值。酸或碱溶液须用BET检查用水在去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。标准内毒素储备液标准内毒素储备液是根据包装上的说明书，制剂标签上标准内毒素储备液的储存和制备，用现行的WHO际标准校准过的US呐毒素标准品制备的。内毒素用EU1示。【注：1EU=1IU内毒素标准液一一将内毒素储备液混合均匀，再用细菌内毒素检查用水对其作适当的系列稀释。尽快使用稀释液，以避免因吸附而失去活性。供试液一一供试溶液是通过用细菌内毒素检查用水溶解、稀释药物制备。某些物质或制剂可能在其他水溶液中被
6、更适当地溶解、稀释。如有必要，调节待测溶液的pH直，使赏试齐怀叶品的混合物pH在由赏试剂生产者定的pH范围内。通常使用于pH范围在6.0-8.0的产品。pH的调节可以用赏试剂生产者推荐的酸、碱或适当的缓冲液。酸和碱可以在已去除内毒素的容器中用浓缩液或固体和细菌内毒素检查用水制备。缓冲剂必须进行验证无内毒素和干扰因子。内毒素储备标准溶液的制备以BET检查用水溶解内毒素10000对照标准品或内毒素100对照标准品，制取细菌内毒素试验（BET）的内毒素储备标准溶液。内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。1EU相当于1个内毒素国际单位（IU）。内毒素标准溶液的制备充分混合内毒素储备标准溶液后，用水稀释，
7、即得BET检查用内毒素标准溶液。得到的稀释液应尽快使用，以免因吸附而导致活性损失。供试品溶液的制备除非另有说明，以BET检查用水溶解或稀释药品来制备供试品溶液。药用容器内盛放的供试品溶液的制备方法见其他具体规程。如有必要，调节待测溶液的pH值，使赏试剂和供试品溶液的混合物的pH值在所选赏试剂的使用pH范围内。一般要求供试品溶液的pH值范围为6.0-8.0。试液或调节pH值用溶?应用BET检查用水配制，在去除内毒素的容器中贮存。内毒素限值的确定及最大有效稀释倍数CP(2015)药品、生物制品的细菌内毒素限值(L)一般按以下公式确定：L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，一以EU/ml、EU/
8、m臧EU/U(活性单位)表示；K人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg?h)表示，注射剂K=5EU/(kg?h),放射性药品注射剂K-2.5EU/(kg?h),鞘内用注射剂K=0.2EU/(kg?h);泌人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/(kg?h)、mg/(kg?h)或U/(kg?h)表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62m2计算。注射时间若不足1小时，按1小时计算。供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量(M)。按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。最大有效稀释倍数是指在试
9、验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数(1-MVD),在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD:MVD=cL/入式中L为供试品的细菌内毒素限值；c为供试品溶液的浓度，当L以EU/m或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml,当L以EU/ml表示时，则c等于l.0ml/ml。如需计算在MVDf的供试品浓度，即最小有效稀释浓度，可使用公式c=X/L;入为在凝胶法中赏试剂的标示灵敏度(EU/ml),或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。EP(8.0)最大有效稀释倍数(MVD指可检测出内毒素限值的供试品溶液的最大稀释倍数。MVDTT列公式确定：MV
10、D=内毒素限值X供试品溶液浓度/入内毒素限值：在剂量的基础上，注射药物的活性成分的内毒素限度为K/MK=人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量（EU/kg）七人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量。专论中，注射剂的活性成分的内毒素限度的单位有IU/ml、IU/mg、IU/生物活性单位等。供试品溶液的浓度表示法：- 当内毒素限度以质量（IU/mg）表7K时，用mg/ml表tk浓度。- 当内毒素限度以（IU/ml）表示时，用ml/ml表示浓度。- 当内毒素限度以生物单位（IU/Unit）表示时，用Units/ml表示浓度。入=指凝胶法中赏试剂的标示灵敏度，或指浊度法或显色法使用的标准回归曲线上最低
11、点（IU/ml）的对应值。USP(36)最大有效稀释倍数（MVD指可检测出内毒素限值的供试品溶液的最大稀释倍数。按下列公式确定：MVD内毒素限值X供t品溶液浓度/入内毒素限度一一注射药品的内毒素限度取决于剂量，等于K/M2,其中蝎每千克体重内毒素的阈值热剂量；M是每千克体重产品的最大推荐剂量。当进行间隔频繁注射和连续输液时，M是指每小时给药的最大总剂量。在药典中，注射药品的内毒素限度规定为EU/mL,EU/mg,EU/单位生物活性等。供试液浓溶液一一mg/mL:内毒素规te为重重（EU/mg）的情况下表tk；Units/mL:内毒素规te为重重（EU/单位生物活性）的情况下表示；mL/mL：内
12、毒素规te为重重（EU/mL.）的情况下表不。入：凝胶法（EU/mD或者用于浊度法和显色法标准曲线的最低浓度的标示灵敏度。JP(16)最大有效稀释倍数（MVD指可检测出内毒素限值的供试品溶液的最大稀释倍数。MVD卜列公式确定：MVD=内毒素限值X供试品溶液浓度/入内毒素限值：根据剂量，注射剂的内毒素限度即为K/M的值，其中K为人每公斤体重可接受的内毒素中热原的最小量（EU/kg）,M指人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量。供试品溶液的浓度表示法：当内毒素限度以质量（EU/mg）表不时，用mg/mL表不浓度。当内毒素限度以（EU/mEq）表示时，用mEq/ml示浓度。当内毒素限度以生物单位（EU
13、/Unit）表示时，用Units/mL表示浓度。当内毒素限度以体积（EU/mD表示时，用mL/mL表示浓度。入：指凝胶法中赏试剂的标示灵敏度（EU/mL）,或为浊度法或显色法使用的标准回归曲线上最低点（EU/mL）的对应值。凝胶法CP(2015)凝胶法系通过赏试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法。赏试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使赏试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为赏试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的赏试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行赏试剂灵敏度复核试验。根据赏试剂灵敏度的标示值（A）,将细菌内毒素国家标准品或细
14、菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2入、入、0.5入和0.25入四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒。取分装有0.1ml赏试齐IJ溶液的10mm75mmt管或复溶后的0.1ml/支规格的赏试剂原安首瓦18支，其中16管分别加人0.lml不向浓度的内毒素标准溶液，廿个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入371C的恒温器中，保温60分钟2分钟。将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180。，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形
15、成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动，造成假阴性结果。当最大浓度2入管均为阳性，最低浓度0.25入管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为赏试剂灵敏度的测定值（1c）。入c=antilg（EX/n）式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最舟-个呈阳性结果的浓度；n为每个浓度的平行管数。当入c在0.5-2入（包括0.5入和2入）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度入为该批赏试剂的灵敏度。干扰试验按表1制备溶液A、B、3口D,使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按赏试剂灵敏度复核试验项下操作。表1凝胶法干扰试验溶液的制备编号内毒素浓度/被加入内毒素的溶液稀释用液稀释倍数稀释后内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液一一一2B2人/供试品溶液供试品溶液1248
