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1、B13 / 14. 诱变(性)：利用细菌进行的回复突变测定1. 测定方法这一测量方法是the OECD TG 471（经济合作与发展组织热重量分析法）的重复，细菌的反向突变测定 (1997)。1.1. 引言细菌的反向突变测定利用需求氨基酸的沙门氏typhimurium菌属和埃希氏大肠杆菌的氨基酸性的必须的应变来发现来检测点突变, 其包括少数DNA碱基的置换、增加或缺失替换附加或划除一到几个DNA 基对 (1)(2)(3)。细菌反向突变测定的原则是它它检测突变，这些回复突变出现在测试菌株中并且修复细菌合成一种基本氨基酸的能力发现能恢复在测定应变中呈现的突变和复位细菌的功能能力以便综合一必要的氨基
2、酸的突变。回复突变菌株通过它在缺乏氨基酸的培养基中的生长而得到检测，而它的父系对这种氨基酸是必需的基因型细菌通过在无被父系测定应变要求的氨基酸环境下生长的能力被发现。点突变是许多人类遗传性疾病的成因并且有关于在致癌基因和肉细胞的肿瘤抑制基因中的点突变与人类和动物样品样品的肿瘤形成有关的实质性的证据。细菌反向突变测定是迅速快速, 廉宜和相对地容易的实施方法。大部分测定应变试菌株有使许多特征，折兑它们检测突变变的更敏感，这些突变包括在回复位点DNA序列的响应它们对包括一些在回复位上、增长细胞浸透性到大分子和除去DNA修复系统或者有错误倾向的DNA修复系统增加情况下响应DNA 序列的突变的发现更灵敏
3、，增加细胞对大分子的透性，消除DNA修复系统的正常功能而增加错误倾向的DNA修复过程。测试菌株的特征能对遗传毒性的试剂引起的突变类型能提供一些有用的信息。测定应变的特征能提供一些关于被神经毒性 药剂衰减的突变类型的有用信息。为大范围结构种类而设的一个非常大的结果实验数据库可用于细菌反向突变测定并且已确立的方法学已经为测定不同的物理化学药品包括挥发性的化合物而被发展。见描述引言部份B.1.2. 定义回复突变测试是利用在沙门氏typhimurium或埃希氏大肠杆菌中测试氨基酸（分别是组氨酸和色氨酸）需求的菌株通过突变变成不在需求外源的氨基酸的反向变化测定发现在氨基酸性的必须的应变中的突变(组氨酸或
4、色氨酸，分别地) 生产一独立与外部提供氨基酸的应变。基本碱基对替换诱导突变是能导致DNA碱基改变的突变。有机体突变物质是引起在 DNA 方面的基本改变的药剂。在一个恢复测定中这一变化可能在最初的突变位置发生, 或者在细菌基因组的第二位置。移码的诱导突变是能够有机体突变物质是引起DNA中一对或者更多的基对增加或缺失，从而改变了RNA的读码结构的突变。附加或划除的药剂，如此变更 RNA 的读数结构。1.3. 初始条件细菌反向突变测定利用原核细胞，其在很多方面不同于哺乳动物细胞在如摄取，新陈代谢，染色体结构和DNA修复过程中的因素。在体外 引导下的测定一般需要利用新陈代谢活化作用的外胚胎资源. 在体
5、外（微晶）下的新陈代谢活化活性系统不能够完全地模仿模拟在哺乳动物活体体内条件下的的系统哺乳动物。因此测定不能提供关于测试物质对哺乳动物物质性的诱导突变和潜在致癌的直接信息有机体突变的和致癌的潜力。细菌反向突变测定被广泛应用于遗传毒性活性、特别是点突变诱导的活性的广泛测试。足够多的实验数据显示很多化学物质在测试中显示阳性，在其它测试中也显示诱变活性。有一些具有诱变活性的化学物质在本测试中没有被检测出来，这些缺陷可以归咎于作为一个为神经毒性作用尤其为点突变诱导作用的初始的掩体被普遍采用。一个广泛的实验数据库展示了在这个测定中很阳性的并说明在其他的测定中诱导有机体突变活动的许多化学药品。有在测定中未
6、被发现的诱导有机体突变药剂的例子;这些缺点的原因能归到终点观测测试的特性，新陈代谢活化作用的不同，或不同的生物药效的不同中。另一方面，提高细菌反向突变测定的敏感因素能导致诱导有机体突变物质活动的过度评估。细菌反向突变测定不可能不适用用在化学药品某一级的评估，例如高度杀菌化合物 (例如，某抗生素) 和那些被认为（或已知的）明确地妨碍哺乳动物样品的细胞复制系统 (例如，一些局部异构酶抑制剂和一些核苷类似物)。在此情况下，哺乳动物样品的突变测定可能是更合理。虽然在此测定中很阳性的许多化合物是哺乳动物样品的致癌物质,相互关系不是绝对的。它依赖于化学药品级并且有不被此测定发现致癌物质因为它们行动超过其他
7、的非 神经毒基因毒性的机制或在细菌的细胞中绝少的机制。1.4. 测定方法原则细菌细胞的悬浮液接触于测试物质存在或存在的缺少外生新陈代谢活化系统的测定中。在平板测试方法中镀层结合法中，这些悬浮液同叠琼脂混合和立即被镀涂布在最小的培养基之上。在预孵化方法中，处理好的混合物被孵化并且然后和琼脂混合再涂布到在电镀在最小的培养基上前的同叠琼脂混合。对此两项技术而言，在经二到三天的孵化后，回复体群体被计算并与在有溶解控制力的镀层溶剂对照涂层上的自然产生的回复体群体的数目相比较。实施细菌反向突变测定的一些实验步骤已经被描述。在其中被普遍采用是镀层涂层结合法 (1)(2)(3)(4)，预孵化法 (2)(3)(
8、5)(6)(7)(8) ，变动流动法(9)(10)和悬浮液法(11)。气体或水汽测定的修正已经被描述为(12)。在方法中被描述的实验步骤主要属于镀层涂层结合法和预孵化法。二者之一对有或没有新陈代谢活化作用的引导实验均是可接受的。一些物质可能被发现在预孵化法中使用更有效。这些物质属于包括短链脂肪族亚硝胺，二价金属，乙醛，偶氮染料和二氮化化合物，pyrollizidine生物碱，烯丙基化合物和硝基化合物(3)的化学级药品。一般能辨认出诱导有机体突变的物质某一级不总是在用镀层涂层结合法或预孵化法的标准实验步骤中被发现。这应该被视为“特别的情形特殊事例 和一般强烈地推荐可选择的实验步骤应该用于它们的研
9、究。下列各项 特别的情形特殊事例 可以被识别 (连同可以用于探测的实验步骤的例子一起): 含氮染料和二氮化合物的混合物(3)(5)(6)(13), 瓦斯和挥发性化学物质 (12)(14)(15)(16) 和葡萄糖甙(17)(18). A来自标准的实验步骤偏离需要科学的校正.1.5. 测定方法的描述1.5.1. 准备1.5.1.1. 细菌细菌的最初的培养直到晚的指数晚期或早的静止平台生长时早期(大约每毫升 109 个细胞). 平台期晚期的培养物在晚期静相中不应该被使用的。在实验中被用的培养包含一个高的浓度测定能养活的细菌是必要的. 浓度测定可以从生长曲线上的以往的实验数据或在每个测定中经过一个电
10、镀涂层的能培养活的细胞数目的测定实验.被推荐的培育温度是 37 C.至少五种细菌的菌种应该被用. 这些应该包括四个菌种s在 S.typhimurium(TA 1535;TA 1537 或 TA97a 或 TA97;TA98;和 TA100) 是在不同实验室之间显示可靠和 可再生性的反应. 这四种 S.typhimurium 菌种有 GC基础碱基对在主要的回复位置。一般情况下可能不测定特定的氧化剂诱导有机体突变的物质。交联的试剂和水合物。这些试剂可能被在主要回复位置有AT基础碱基对的 E.大肠杆菌 WP2 菌种或 S. typhimurium TA102(19)测定到因此被推荐的菌种的组合是:
11、S. typhimurium TA1535,和 S. typhimurium TA1537 或 TA97 或 TA97a,和 S. typhimurium TA98,和 S. typhimurium TA100,和 E.大肠杆菌 WP2 uvrA,或 E.大肠杆菌 WP2 uvrA(pKM101),或 S. typhimurium TA102.为了要测定到交联的的诱导有机体突变的物质它最好包括 TA102 或E.coli 的DAN修补菌种. 例如. E.大肠杆菌 WP2 或 E.大肠杆菌WP2(pKM101)应使用已成型的原料繁殖培养、标记物确认和储藏步骤。 氨基酸生长需要在冰冻的繁殖培养皿中
12、进行。 (组氨酸对S. typhimurium 菌种和,色氨酸对 E. 大肠杆菌菌种). 其他的显型应该同样地被检查,即: 是否在合适位置出现 R- 因子等离子体如菌种 TA 中的 氨比西林 对抗在菌种TA98,TA100 和 TA97a 或 TA97 ， WP2 uvrA 和 WP2 uvrA(pKM101),和 氨比西林 +四分染色体在对抗菌种 TA102; 特征突变的存在 (如rfa在S. typhimurium 中的突变在 S 中的变化.通过紫色水晶的感光度和 uvrA在 E.大肠杆菌中的突变uvrB在S. typhimurium中的突变,通过紫外光检验) (2)(3).菌种应该产生计
13、算在实验室的历史控制数据中的频率范围内的自然的回复突变等位基因群体板块并在参考文献报道过的范围内.1.5.1.2. 媒质介质使用一个合适的小琼脂 ( 例如包含最小的Vogel-Bonner媒介物 E 和葡萄糖),和一个覆盖琼脂，包括组氨酸和维生素 H 或色氨酸用于少数细胞分离，在(1)(2)(9)中使用过。1.5.1.3. 新陈代谢活化无论是否在一个合适的新陈代谢系统中，细菌都应该接触测定物质。最普遍的系统是补体因子补充的从啮齿动物样品的肝脏中提取的酶激发试剂（例如Aroclor 1254(1)(2)或本巴比妥和萘黄酮(18)(20)(21)处理的线粒体片断。线粒体片断经常使用的浓度范围在S9
14、-混合物，体积比从5%到30%，新陈代谢活化系统的选择和条件可能依赖于被测化学物质的等级，在有些情况下，它可能对多于一种浓度的线粒体片断适用。对azo- 染料和二氮化合物的-混合物使用一个还原新陈代谢活化系统可能更适当 (6)(13).1.5.1.4. 测定物质/准备固体测定物质应该溶解或延缓悬浮在合适的溶剂或媒介物中并且如果合适的话就在处理前稀释，液体测定物质应该直接加到测定系统中并且/或在处理前稀释。新鲜准备的应该使用，除非稳定数值证明储藏的可接受性。溶剂/媒介物不应该与测定物质化学反应，不符并且应该和细菌和S9活动生存共处。如果不是用的众所周知的溶剂/媒质，它们的内含物应该被它们的共有的
15、预测实验数据所支持。可能的话建议首选水溶剂/媒质。当测定对水不稳定的物质时候,使用的有机溶剂应该无水.1.5.2. 测定情况1.5.2.1. 测定菌种 (见1.5.1.1)1.5.2.2. 暴露浓度决定最高的使用的测定物质含量时，需要考虑到的标准条件之一是在最后处理混合物时细胞的毒性和溶解度.在初步的实验中决定的毒性和溶解度可能是有用的。细胞毒性可能通过回复菌群数目的衰减被测定到。对菌苔生长背景的清除或缩小或所处理的培养物的存活程度。一种物质细胞毒性可能随着新陈代谢系统的变化而变化。在实际测定条件下，很明显不溶物应该在最后的混合物中作为沉淀。我们推荐测定可溶的无细胞毒性的物质的最大浓度为五毫克
16、每盘板或五微升每盘板。对于溶解度小于五毫克每盘板或五微升每盘板的无细胞毒性物质在最后处理混合物时应有一到多个被测浓缩物不溶。有细胞毒性的待测物质的溶解度若已低于五毫克每盘板或五微升每盘板则应测到某一细胞毒性浓度。记录时不应受沉淀物的影响。在最初的实验中，至少要有五种不同的可分析的待测物质的浓缩物，在测定点之间用半对数。当研究调查一个浓缩-浓度- 反应曲线时使用较小的间隔较为合适。在上述测定中，当评估确实含有能引导基因突变的杂质时，应考虑五毫克每盘或五微升每盘的浓缩物。1.5.2.3. 阴性和阳性的对照组协同的特定菌种阳性的和阴性的对照组无论参不参与新陈代谢，都应在每次测定中有所涉及。在测定中应选择有阳性反应的阳极对照组的浓缩物。对于涉及到新陈代谢系统的测定，应在所用细菌的菌种的类型的基础上选择阴极对照组的参考物质。下列各项物质为在涉及新陈代谢的测定中恰当的
