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1、免 疫 共 沉 淀 (Co-IP) 详 细 步 骤 教 程 ( 转 )http:/ 免疫共沉淀 （ Co-Immunoprecipitation ）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的 用于研究蛋白质相互作用的经典方法。 是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有 效方法。 其原理是： 当细胞在非变性条件下被裂解时， 完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白 质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质 X 的抗体免疫沉淀 X ，那么与 X 在体内结合 的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在 argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上
2、的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合； 也可用于确定一种特定蛋白质的新的 作用搭档。其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的， 可以避免人为的影响； （3）可以分离得到天然状态的相互作 用蛋白复合物。 缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合， 而可能有第三者在中间起桥梁作用； （3）必须在实验 前预测目的蛋白是什么， 以选择最后检测的抗体， 所以，若预测不正确， 实验就得不到结果， 方法本身具有冒险性。二、准
3、备工作：预冷 PBS， RIPA Buffer ，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下） ，离心机1. 用预冷的 PBS 洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的 RIPA Buffer（1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5 X 106 个细胞、 6cm 培养皿、 75cm2 培养瓶 ）3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4C,缓慢晃动 15min （ EP 管插冰上，置水平摇床上）4. 4C, 14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS洗
4、两遍珠子，然后用 PBS配制成50%浓度，建议减掉枪 尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100 l Protein A琼脂糖珠（50%）, 4 C摇晃10min （EP管插冰上， 置水平摇床上） ，以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4C, 14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子8. （Bradford 法）做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20 C保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约 1卩g/卩l，以降低裂解液中去垢剂
5、的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10卩g/卩l）10. 加入一定体积的兔抗到500卩l总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11.4 C缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育12. 加入100卩l Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4 C缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2卩l过渡抗体”（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800卩1/遍，RIPA
6、buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以 使用 PBS14. 用60卩I 2X上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据 上样多少的需要而定（60卩l足够上三道）15. 将上样样品煮 5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20C，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。RIPA Buffer 配制：基础成分：Tris-HCl （缓冲液成分,防止蛋白变性）NaCl （盐份,防止非特异蛋白聚集）NP-40 （非离子去污剂，提取蛋白；用 H2O配制成10%储存液） 去氧胆酸钠（离子去污剂,提取蛋白；用
7、 H2O 配制成 10%储存液；避光保存） 注意：准备激酶（致活酶）实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够使酶变性, 导致活性丧失。RIPA 蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）（用异丙醇配制成 200mM的储存液，室温保存）EDTA （钙螯合剂；用 H2O配制成100mM的储存液，PH 7.4）亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20C保存） 抑蛋白酶肽（Aprotinin ）（用H20配制成1mg/ml的储存液，分装，-20 C保存） 胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的储存液，分装，-20C保存） RIPA 磷酸
8、（酯）酶抑制剂激活的 Na3VO4 （用 H2O 配制成 200mM 的储存液,见 Sodium Orthovanadate Activation Protoco）NaF（200mM 的储存液,室温保存） 注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候,不加磷酸酯酶抑制剂工作液配制：配制 100ml 的 modified RIPA buffe ：1. 称取790mg的Tris-Base,加到75ml去离子水中，加入 900mg的NaCI，搅拌，直到全 部溶解,用 HCl 调节 PH 值到 7.42. 加 10 ml 10%的 NP-403. 加 2.5 ml 10%的去氧胆酸钠,搅拌,直到溶液澄清4.
9、力口 1 ml 100mM 的EDTA，用量筒定容到 100ml, 2-8 C保存5. 理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各 100卩l; PMSF, Na3VO4, NaF 各500卩l），但是PMSF在水溶液中很不稳 定， 30 分钟就会降解一半，所以 PMSF 应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液 中稳定 5 天。各种成分在工作液中的终浓度：* Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4* NP-40: 1%* 去氧胆酸钠： 0.25%* NaCl: 150 mM* EDTA: 1 mM* PMSF: 1 mM*抑蛋白酶
10、肽，亮抑酶肽 胃蛋白酶抑制剂：各1卩g/ml* Na3VO4: 1 mM* NaF： 1 mM三、实验流程为：( 1 )转染后 24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂) ，冰上 裂解30min,细胞裂解液于4 C,最大转速离心 30 min后取上清；(2) 取少量裂解液以备 Western blot分析，剩余裂解液加 1卩g相应的抗体加入到细胞 裂解液， 4 C 缓慢摇晃孵育过夜；(3) 取10卩l protein A琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗 3次，每次3,000 rpm离心3 min ;(4) 将预处理过的10卩l protein A琼脂糖珠加入到和抗体孵育过
11、夜的细胞裂解液中4 C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连；( 5)免疫沉淀反应后， 在 4 C 以 3,000 rpm 速度离心 3 min ，将琼脂糖珠离心至管底； 将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3- 4次；最后加入15卩l的2 X SDS上样缓冲液，沸水煮 5 分钟；( 6) SDS-PAGE, Western blotting 或质谱仪分析。通过免疫共沉淀确定结合蛋白 1用磷酸盐缓冲液洗 30 块 10 cm 培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到 1 ml 冰冷 的 EBC 裂解缓冲液中。2 将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4
12、 C以最大速度离心15 min。3收集上清(约 30 ml)并加入30卩g的适当抗体，4C摇动免疫沉淀物1 h。4. 加入0.9 ml的蛋白质 A-Sepharose悬液，4C摇动免疫沉淀物 30 min。5. 用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗 5次。最后，用 NETN 洗一次。6. 吸出混合物的液体部分。加入800卩l的1 X SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4 min。7. 将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE 梯度胶中，在 10 mA 的恒定电流下电泳过夜。8. 通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。9. 从胶上切下目标带，将其放到微
13、量离心管中，用1ml 50%乙腈洗两次，每次 3 min。10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。 将收集的肽在 ABI 477A 或 494A 机器上进行自动 Edman 降解测序。四、注意的问题：(1) 细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互 作用，多采用非离子变性剂(NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通 过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2% SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的 cocktailer 。( 2)使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用( 3)使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的 IgG 或另一类单抗 兔多克隆抗体：正常兔 IgG在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性，应注意以下几点：(1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆 抗体的使用有助于避免污染的发生；(2) 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉 淀；(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要 进行蛋白质的定位来确定
