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1、福建农林大学生物工程研究法课程实验方案发酵工程研究法学 院：生命科学学院专业年级: 07微生物一班组 长：李彩斌指导老师：孙淑静小组成员：马起铝，李国凡 蓝金莲 叶碧霞 郑梅钦 李彩斌 发酵工程课程实验方案一、实验目的1、掌握发酵微生物菌种筛选原理和方法2、学习和掌握酒精发酵方法和发酵过程的监测方法3、掌握酒精对糖和淀粉的转化率的计算方法二、实验原理培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌。发酵成熟醪的成分随原料的种类、加工方法、菌种性能不同而不同，分成不挥发性成分和挥发性成分两大类。
2、许多微生物都能利用已糖化进行酒精发酵，但在实际生产中用于酒精发酵的几乎全是酒精酵母，俗称酵母。利用淀粉质原料的酒母在分类上叫啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，是属于子囊菌亚门酵母属的一种单细胞微生物。该种酵母菌繁殖速度快，发酵能力即产酒精能力强，并具有较强的耐酒精能力。淀粉质原料酒精生产的工艺流程如图所示：三、实验材料、试剂和器材1、原料：玉米粉、已知酶活力糖化酶 2、试剂：氢氧化钠、盐酸、硫酸、DNS、碘液、pH4.6的醋酸盐缓冲液3、器材：三角瓶、试管、培养皿、血球计数器四、实验步骤(一) 酵母菌种的分离与筛选1、称量50g的从超市中买来的葡萄放置捣烂，溶于上述
3、的90ml的无菌水中，振荡30min，制成原液。2、在超净台上，取1ml原液于9ml装有无菌水的试管中，摇匀，制成10-1菌液，按照同样的方法做成6个稀释梯度，难后选择4个合适的梯度进行涂平板，培养基为孟加拉红培养基，封口，每个梯度涂布三个重复。3、将平板倒置于37培养箱中培养3-4d。 4、观察菌落的生长情况，选取菌落生长均匀的浓度梯度，进行划线分离纯化。5、在37培养箱中在培养3d。6、选取分离纯化好的单菌落用显微镜进行观察。酵母菌落形态一般大而突起，边缘可见球状、卵圆状或假丝状细胞。7、挑取鉴定出来的菌落与PDA液体培养基中进行增殖培养。 (二) 酵母产酒精1、糊化：将600ml水加到糖
4、化锅中，按照料水比1：4的比例称量玉米粉150g，调节pH值为5-6，加入氯化钙(对固形物0.2)，加入液化酶(12-20U/g淀粉)，在剧烈搅拌下，先加热至72，保温15min，再加热至90，并维持30min，以达到所需的液化程度(DE值：15-18)，碘反应呈棕红色。液化结束后，再升温至120，保持5-8min，灭酶，压滤去渣，降温就可以进行糖化了。2、糖化：液化结束后，迅速将料液用硫酸将pH调至4.3-4.5，同时迅速降温至60。按照0.6-0.8%/g淀粉的比例加入糖化酶，搅拌均匀，放入水浴锅中，60保温若干小时后（10h左右），当用无水酒精检验无糊精存在时。用碘液测定糖化液是否还含有
5、淀粉，若未完全则继续糖化直至完全为止。注意开始时液面位置并随时补足蒸发掉的水分。糖化结束后，将料液pH调至4.8-5.0，同时，将料液加热至加热90，保温30分钟然后将料液温度降至60-70，开始过滤。3、发酵前还原糖测定：取一些糖化好的糖化液，测定其还原糖的含量(用DNS法测定)。 3.1葡萄糖标准曲线制作取6支试管，按下表1顺序加入各种试剂。表1 不同浓度葡萄糖的光密度试管编号123456蒸馏水32.52.01.51.00.5500ug/ml葡萄糖00.511.52.02.51各加入DNS试剂2.0mL； 2沸水浴加热5min； 3立即用流水冷却； 3定容至25mL；550nm处测定OD值
6、最后以葡萄糖含量（mg/mL）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。3.2 糖化液还原糖测定(1)取5ml糖化液进行过滤，滤液用pH4.6的醋酸盐缓冲液进行稀释，约稀释10-100倍。(2)取甲乙两支10ml的试管，甲试管加入1ml稀释的糖化液，乙试管加入1mlpH4.6的缓冲液，分别加入2mlpH4.6的醋酸盐缓冲液和2mlDNS试剂。混匀后沸水浴加热5min，立即冷却定容到5ml。(3)混匀分别于550nm处比色，用乙试管调零，测3次，记录光密度值。(4)然后在标准曲线上查得相应的还原糖含量Gmg。(5)根据以下公式计算样品中还原糖的含量：还原糖含量(mg/ml)=Ga（a-稀释倍数，
7、G-还原糖量(mg)）4、发酵：将糖化好的糖化液分装于三角瓶中，每瓶接种约15ml已培养24h的酵母菌，塞上胶塞（在加入的时候一定要注意防止杂菌的侵入，严格使用酒精火保护罐口，并保持罐内正压）。5、用干布将三角瓶各部分擦干净，称量初始发酵液的重量，将发酵液放于30的培养箱中发酵，并于以后每天称量一次，直至重量减至恒重为止。并用DNS法测定发酵后的还原糖含量。(三) 酒精发酵液各项指标测定1、酒精度测定：1）蒸馏：装好全套蒸馏装置，取100ml发酵能力较强的发酵液，放入500ml的蒸馏瓶中，加入100ml水，迅速安装到冷凝管上进行蒸馏，将容量瓶置于冷凝管下端收集馏出液100ml时，停止蒸馏，摇匀
8、备用。2）将酒精比重计慢慢放入酒精发酵液的蒸馏液中，手持温度计在比重计杆旁，待温度稳定后，酒精停稳定时读数，读数时视线应与刻度计相平。3）校正：根据所量的酒精度和温度、查表校正为20度时的酒精度。2、发酵液还原糖的测定：方法同发酵前还原糖测定方法一样3、酒精发酵液的微生物检查（1）酵母形态的观察用美蓝染色法取酒精发酵液菌体进行制片，在放大40倍及100倍的显微镜下观察酵母形态，用测微尺测量酵母细胞的大小，并进行死活鉴别。具体步骤如下： 首先，在载玻片中央加一滴0.1%美蓝染色液，液滴不可过多或过少，以免盖上盖玻片时，溢出或留有气泡。然后按无菌操作法取在发酵液上培养了48小时的筛选出的酵母菌悬液
9、一滴，放在美蓝染色液中，使菌体与染色液均匀混合。取盖玻片一块，小心地盖在液滴上，不能将盖玻片平放下去，应先将盖玻片的一边与液滴接触，然后将盖玻片慢慢放下，这样可以避免产生气泡。放置3Min。 其次，将制好的水浸片先用低倍镜观察，半个小时后用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死活细胞，因为活细胞的新陈代谢不停地进行着，所以细胞内氧化还原值(rH)颇小，而还原力强，若有无毒的染料进入细胞，即被还原脱色，但死细胞及代谢缓慢的老细胞无此还原力。美蓝无毒，且能为活细胞还原成无色，故可用以区别细胞的死活。但美蓝浓度、作用时间等均有影响，应加注意。（2） 酵母细胞数的测定(酵母耐酒精能力的测定) 1）取样检测获细胞数目，用血球计数法：用适当稀释的酵母菌液，加到盖有盖玻片的血球计数板上，根据所数计数格内的细胞数、加入的菌液量和稀释倍数，计算出每毫升菌液的含菌量。2）耐酒精能力的测试：配成浓度为0 2% 。等的水浓液加入等量的扩培过的酵母浓液，每隔2小时用血球计数板测酵母数目(改成血球计数板测数目)（3）不同酵母菌产酒精能力的测定本实验主要采用称重法与放出二氧化碳量等测定酵母的发酵能力：发酵瓶于30温箱中进行培养，每天称重一次，记录重量，由于每瓶用于发酵的糖化液体积相同，所以只需计算出单位时间内CO2释放量
