非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

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1、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)的分类有三种常用的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法：blue native (BN-PAGE), clear native(CN-PAGE), quantitativepreparativenativecontinuous (QPNC-PAGE)。在一个典型的nativePAGE方法中，复合物被CN-PAGE或BN-PAGE分离。然后可以用其它分离方法如SDS-PAGE或等电聚焦做进一步分离。随后切割凝胶，蛋白复合物每一个部 分都被分开。蛋白的每个条带可以消化后做肽链指纹图谱或重新测序。这样就可以提供一个 蛋白复合物中单个蛋白的重要信息。1. Bl

2、ueNativePAGEBlue Native PAGE是最古老的Native-PAGE技术。是以考马斯亮蓝作为电泳分离后蛋白质鉴定染料的一种电泳方法。这种方法的缺点是：考马斯亮蓝与蛋白的结合起到了去垢剂的 作用，可能导致复合物的分离；并对化学发光或蛋白质辅基的荧光或荧光染料的标记具有潜 在的猝灭作用。BlueNativePAGE在分析蛋白质-蛋白质相互作用以及膜蛋白复合物方面有很大的优势，其分离范围在100KDa-10MDa。在Blue native PAGE过程中，最重要的化合物就是考马斯 亮蓝，除了增溶作用以外，蛋白质表面结合了大量的考马斯亮蓝染料而带上负电荷，这会导 致即使碱性蛋白在p

3、H7.5条件下也会向阴极迁移。但是，蛋白质虽然带有大量的负电荷，然而其分离依据的根本还是根据不连续的凝胶梯度-凝胶孔径的逐渐减小，蛋白质最终迁移 到其自身大小与凝胶孔径相近似的位置而停止。并且在分离膜蛋白的过程中，由于带有负电荷，而不会引起蛋白聚合，与酸性染料的结合，膜蛋白也由疏水性变成亲水性，溶解性大大 提咼。1.2 ClearNativePAGEClearNativePAGE是通过除染色以的其它方法如SLS鉴定蛋白的电泳技术。然而，这种方法最大的应用还是研究蛋白质-蛋白质相互作用，特别是和质谱联用。技术，分辨率通常比BN-PAGE低。迁移距离决定于蛋白的固有电荷和凝胶孔径大小。因此，BN-

4、PAGE比CN-PAGE应用更广泛。然而CN-PAGE在考马斯染料分析天然混合物干扰进 一步分析时存在着优势。如测定催化活性(例如线粒体ATP合酶)或分离用于荧光共振能 量分析的微量膜蛋白,CN-PAGE比BN-PAGE更温和，特别是使用洋地黄皂苷时,CN-PAGE 可以保持膜蛋白的超分子组合体的结构而BN-PAGE会导致分解。线粒体ATP合酶中的具 有酶活性的低聚物可以用CN-PAGE检出，但BN-PAGE无法检出。CN-PAGE起源于无色非变性PAGE，是BN-PAGE之后出现的技术。既然CN-PAGE中没 有带电荷的染料，蛋白在电场中的迁移完全取决于这个蛋白的固有电荷。大分子和低聚蛋白

5、必须有合适的物理参数才能在CN-PAGE中分开，特别是PI低于5.4,分辨率低。由此看来， CN-PAGE除了获得未染色的蛋白以外在分析膜蛋白中没有什么优势了。优点是条件更温和， 在蛋白质组学研究中具有更大优势。BN-PAGE和CN-PAGE的缓冲液和电泳条件一致，但 是CN-PAGE的阴极缓冲液中不含考马斯染料,而是将0.025%的洋地黄皂苷加入到凝胶中。1.3QPNC-PAGEQPNC-PAGE ( quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis)是一种应用于生物化学和生物有机化学的

6、根据等电点分离蛋白的高分辨 技术。这种凝胶电泳被生物学家应用于独立活性或天然金属蛋白样品或正确或非正确折叠的 可溶性的与金属辅助因子结合的蛋白混合物的鉴定。131电泳缓冲液QPNC-PAGE是在特殊的装置里进行的分离生物活性分子的电泳过程。在特殊的电泳缓冲 系统(基于Tris-HCl和NaN3)中，一个生物系统中的大多数蛋白都会带电荷，在电场的 正负极之间迁移。尽管PH(10.00)的电泳缓冲液并不与细胞或组织中的生理PH相符，但是在生理PH(8.00) 的缓冲体系下蛋白会连续洗脱并分成不同的部分。分离系统包括电泳槽和分部收集器，这些 装置要置于冰箱中。1.3.2凝胶特征为了得到一个PAGE所

7、需的聚合完全的凝胶，聚丙烯酰胺凝胶需要在室温下凝聚69hr。最 后，得到均质的含机械稳定和自由的单体或原子。凝胶的孔径很大，因此分子筛作用在电泳 分离中最小化。基于上述原因，凝胶和活性分子之间的相互作用可以忽略。待分离的金属蛋 白（如金属分子伴侣，蛋白酶感染性初级因子，金属运输蛋白，淀粉状蛋白，金属酶，金属肽等）不会分解成脱辅蛋白和金属辅助因子。孤立蛋白的生物活性结构（天然或3D构象）在QPNC-PAGE后不会发生构象变化。所以，金属蛋白和蛋白异构体在PAGE中被定量的分成高纯度的部分。QPNC与其它电泳技术如SDS-PAGE，2-DE，等速电泳和CN-PAGE等相比被称为“突破性的方法”。1

8、33实验方法（1）储备液1）200mMTris-HCI10mMNaN 3PH10.00，室温2）200mMTris-HCI10mMNaN 3PH8.00，室温3）40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺2.67C，4C（新鲜）（2）电泳缓冲液20mMTris-HCl1mMNaN 3PH10.00 （除气），4C电泳槽上部：500ml电泳缓冲液电泳槽下部：2000ml电泳缓冲液（3）洗脱液20mMTris-HCI1mMNaN 3PH8.OO （除气）,4C洗脱室：700ml洗脱缓冲液（4）分离胶丙烯酰胺4%T体积40ml成分：4mI40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺2.67C4mI200mMTris-HCI10mMN

9、aN 3PH10.0032mLH 2O200 p L10%APS20 p LTEMEDAPS和TEMED最后加入。轻轻搅拌烧瓶中的混合物，注意不能产生气泡。然后把溶液移 入内径为28mm，长为40mm有刻度的玻璃柱中。加入3ml正丙醇。60分钟聚合后用电泳 缓冲液冲洗凝胶，然后用4ml电泳缓冲液覆盖凝胶表面。在室温下凝集69小时。（5）样品的准备和收集保持样品（生物液体）温度为4C。0.3ml甘油和2.7ml样品在分离前混合5分钟。然后把处 理好的样品加入到电泳缓冲液的上层。这些蛋白在此电泳缓冲液中不是带负电（PI10.0）,因此在电场中不是从正极迁移到负极就是从负极迁移到正极。已分离的蛋白分

10、子用特殊的生理洗脱液连续洗脱，并用分部收集器收集。整个分离系统必须在4C冰箱中进行。纯化的，半纯化的和未处理的样品都可以用于QPNC。样品分离纯化中应该避免类似于蛋 白质沉淀等过程以防止蛋白变性。化学稳定的金属蛋白可以用非变性的凝胶渗透层析来进行 进一步纯化。1.3.4定量和鉴定Fe, Cu， Zn, Ni， Mo， Pd， Co， Mn, Pt， Cr， Cd和其它金属辅因子可以通 过 ICP-MS (Inductivelycoupledplasmamassspectroscopy，电感耦合等离子体质谱) 来定性和定量。因为PAGE条带的高纯度和选择性凝集，相关的结构可以用非变性条件下的 N

11、MR来分析。135应用QPNC的应用对象为分子量6-200kDa的酸性、碱性和中性金属蛋白。在测定血液或其它临 床样品中独立的金属蛋白结构和功能关系方面具有重要应用，因为不正确的金属陪伴蛋白的 折叠。例如超氧化物歧化酶(SOD)的铜陪伴蛋白出现在这些基质中或许预示着神经病变 疾病如肌萎侧索硬化病等。QPNC-PAGE，SEC，ICP-MS和NMR等技术的连用可以得到 病人或潜在的病人液体基质中相关金属蛋白的生理状态的结构。这一技术可以提高蛋白错折 叠相关疾病的诊断和治疗水平。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)原理、方法步骤与常见问题分析分离碱性蛋白要用低pH凝胶系统，并使用以下

12、缓冲液体系：1. 分离胶：0.06M KOH, 0.376M Ac, pH4.3 (7.7% T，2.67% C)；2. 堆积胶：0.06M KOH, 0.063M Ac, pH6.8(3.125% T, 25% C)；3.电泳缓冲液：0.14M 2-丙氨酸,0.35M Ac, pH4.5将正负电极倒置，用甲基绿(0.002%)为示踪剂实验操作同分离酸性蛋白。回收n ative-PAGE结束以后，采用电泳的方法进行回收，方法如下：电泳结束以后，切取部分染色，然后根据染色结果切取含有蛋白质的胶带装入处理过的透析 袋中，加入适量的缓冲液，最后把透析袋放入普通的核酸电泳槽中，并在电泳槽中加入适量的缓

13、冲液(和透析袋中的缓冲液相同)，低温电泳2-3小时即 可。回收蛋白所用的缓冲液一般和电泳所用的缓冲液相同。SDS-PAGE 和 Native-PAGE 的比较非变性凝胶电泳，也称为天然凝胶电泳，与非变性凝胶电泳最大的区别就在于蛋白在电泳过 程中和电泳后都不会变性。最主要的有以下几点：1. 凝胶的配置中非变性凝胶不能加入SDS，而变性凝胶的有SDS。2. 电泳载样缓冲液中非变性凝胶的不仅没有SDS，也没有巯基乙醇。3. 在非变性凝胶中蛋白质的分离取决于它所带的电荷以及分子大小，不像SDS-PAGE电泳 中蛋白质分离只与其分子量有关。4. 非变性凝胶电泳中，酸性蛋白和碱性蛋白的分离是完全不同的，不

14、像SDS-PAGE中所有 蛋白都朝正极泳动。非变性凝胶电泳中碱性蛋白通常是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。5. 因为是非变性凝胶电泳，所有的电泳时候电流不能太大，以免电泳时产生的热量太多导 致蛋白变性，而且步骤都要在0-4度的条件下进行，这样才可以保持蛋白质的活性，也可以 降低蛋白质的水解作用。这点跟变性电泳也不一样。所以与SDS-PAGE电泳相比，非变性凝胶大大降低了蛋白质变性发生的机率问题和解答1.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时预电泳是怎么回事的？预电泳时要加6XDNA上样缓冲液 吗？电泳1 2小时再加结合反应产物吗？预电泳是除去凝胶中没有聚合的单体和双体和聚

15、合引发剂，提高分辨率，不加任何物质，一 般3 0 6 0分钟后加样电泳。现在大家都是做SDS-PAGE或者双向电泳比较多，而做非变性电泳的似乎少一些。而我本人 接触非变形电泳较多，一直认为它还是很有特点的，能够有很多独特应用之处的，所以在此 结合我本人经历向大家介绍一下非变性电泳。非变性电泳，蛋白质在电泳过程中是处于非变性的，电泳时蛋白的迁移率取决于蛋白的电荷 和分子量，非变性电泳在完成电泳后，可以进行蛋白质活性测定（如果是酶的话，可以进行 酶活检测）或者检测同功酶，或含亚基的完整蛋白的分子量，这些特点是SDS-PAGE所不具 备的，因为像SDS-PAGE使蛋白变性，亚基解离，无法体现含有亚基的蛋白的真实分子量， 也无法进行后续的蛋白活性检测了。非变性电泳和SDS-PAGE相比，其实基本试验操作是相同的，所以在此我也不一一详叙了。 最大的不同就是样品中的蛋白是没有变性的，所以电泳样品是没有煮沸的，而且样品处理液 中也是不含去垢剂的。此外的差异还有：1在非变性电泳中，体系的PH通常为8.8（浓缩胶和分离胶的PH 8.8）因而大多数蛋白质 在这个条件下是带负电的。当然我想地球上也会有pl大于8.8的蛋白质，这样的条件下，要 用低PH系统（这个完全是另一套系统，缓冲体系也不同，我这里就不深入了，有兴趣的可 以去参考一下汪家政主编的蛋白质技术手册，同时把电泳体系得阴极