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1、Western-Blot操作流程 试剂配制蛋白提取试剂1. RIPA裂解液: 50mM Tris(MW121.14,PH7.5) 3.02g 150mM NaCl 4.38g 1%TritonX-100 5ml 1%脱氧胆酸钠 5g 0.1%SDS 0.5g 蒸馏水至 500ml。 调pH值至7.5。混匀后4保存,长期保存于-20。使用时,加入蛋白酶抑制剂cooktail。2. 蛋白酶抑制剂cooktail 所需母液成分: (1)100mmol/L PMSF PMSF 17.4mg 异丙醇 1ml 溶解后,分装于1.5ml离心管中,-20保存。 (2)10mM 亮肽素leupeptin: -2
2、0保存 (3)2.1mg/ml 抑肽素Aprotinin: 4保存 配制: 成分 终浓度 每ml裂解液所加母液量 PMSF 1mmol/L(储存浓度稀释100倍) 10ul Leupeptin 0.1mmol/L(储存浓度稀释100倍) 10ul Aprotinin 1ug/ml (储存浓度稀释2000倍) 0.5ul 各成分直接加入所用的RIPA裂解液中 ,之后按照60ul/孔(12孔板)提取蛋白。蛋白定量试剂1. G250考马斯亮蓝溶液(蛋白定量专用)考马斯亮蓝G250 100mg 95乙醇 50ml 85磷酸 100ml 蒸馏水至 1000ml 配制时,先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料,再加入
3、磷酸和水,混匀后,用滤纸过滤,4保存于棕色瓶中。2牛血清白蛋白BSA储存液(1mg/ml):100mg BSA粉末溶于20 ml双蒸水,定容至100 ml,加少量防腐剂,4保存。上样用试剂14X上样缓冲液 1.0 mol/L TrisHCl(pH6.8) 2ml SDS 0.8g 溴酚蓝 0.04g 甘油 4ml去离子水定容至10ml。混匀后,分装于1.5ml离心管中,4保存。使用时稀释成1X。21.0 mol/L二硫苏糖醇(DTT)(10X)用20 ml 0.01 mol/L乙酸钠溶液(pH5.2)溶解3.09g DTT,分装成1ml小份储存于-20C。使用时稀释成1X。例如:上样量20l-
4、4X上样缓冲液 5l+ DTT 2l + 样本蛋白13l工作液制胶用(1-6):1. 1.0mol/L TrisHCl (pH6.8)Tris (MW121.14) 12.114g 蒸馏水 100ml 溶解后,(用浓盐酸调pH至6.8),室温下保存。 2. 1.5mol/L TrisHCl(pH8.8)Tris (MW121.14) 18.171g 蒸馏水 100ml 溶解后,(用浓盐酸调pH至8.8),室温下保存。 3. 10SDS SDS 10g 蒸馏水至 100ml 如溶解困难,可在50水浴下溶解,室温保存。 如在长期保存中出现沉淀,水浴溶化后,仍可使用。 4. 10过硫酸胺(AP)过硫
5、酸胺 0.1g 蒸馏水 1ml (现用现配,可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中,一次性多装几管,使用时加入蒸馏水水即可,溶解后,4保存,保存时间为1周) 5 四甲基乙二胺原液(TEMED): 4C保存。6 30%丙稀酰胺: 4C保存。10%下层胶(两块胶,15ml):依次加入 去离子水 5.9ml30%丙烯酰胺 5ml1.5M Tris-HCl(pH8.8) 3.8ml10%SDS 150l10%AP 150lTEMED 6l每加一种成分随即摇匀,为了加快凝胶,可以将过硫酸胺和TEMED量加大,根据实验当时的温度适当调整,加入TEMED混匀后应即刻灌胶。灌胶后加正丁醇(1ml)
6、消泡5%上层胶(两块胶,6ml):依次加入 去离子水 4.1ml30%丙烯酰胺 1ml1M Tris-HCl(pH6.8) 0.75ml10%SDS 60l10%AP 60l TEMED 6l每加一种成分随即摇匀,为了加快凝胶,可以将过硫酸胺和TEMED量加大,根据实验当时的温度适当调整,加入TEMED混匀后应即刻灌胶。7 5X电泳液缓冲液 Tris(MW121.14) 15.1g 甘氨酸(MW75.07) 94g SDS 5.00g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释5倍,通常取160ml配制成800ml即可。 8 10X转膜缓冲液 甘氨酸(MW75.07) 151.1g Tr
7、is(MW121.14) 30.3g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释10倍,并加入甲醇至20%。 通常取80ml母液,加560ml蒸馏水,最加160ml甲醇,配制成800ml即可。(先加甲醇易产生沉淀) 9 10XTBS缓冲液 Tris(MW121.14) 24.2g NaCl 80.0g 蒸馏水至 1000ml (浓盐酸调pH至7.6),溶解后室温保存。 101XTBST缓冲液10XTBS缓冲液 100ml 蒸馏水 900mlTween-20 1 ml因Tween-20比较粘稠,应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块,即可防止产生气泡。溶解后室温保存。11封闭液/抗体稀释液(5%脱脂
8、牛奶): 1XTBST缓冲液 95-100 ml 脱脂奶粉 5g溶解后4保存,可于一周内使用。其他商品性试剂一抗、二抗、显影液、定影液、ECL化学发光试剂操作步骤 (一) 蛋白样品制备 (1) 单层贴壁细胞总蛋白的提取:1、 倒掉培养液,将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液,(暂不作可将培养皿存于-80度)。 2、 向培养皿中加入裂解液,通常6孔板150-200ul/孔,12孔板50-60ul/孔,冰上放置,摇床20min 3、 用勺子刮下细胞,并吸出液体至1.5ml离心管中,勺子在处理不同样本前清水洗净、擦干(注意冰上操作) 4、 超声处理(可选)注意蛋白悬液放于冰上,15sec处理,dut
9、y cycle 50-60 每次处理后清水洗探头、擦干,再作下一个 5、 于4下12000rpm离心5min。 6、 将离心后的上清分装转移倒1.5min的离心管中放于-80保存。 (2) 组织中总蛋白的提取: 1.将200mg组织块剪碎,置于1ml裂解液中(5ml离心管)。 2.匀浆器进行匀浆,注意冰上操作,匀浆后置于冰上。 3.10,000g ,4,10min,(5ml管) 4.取上清至1.5ml管,12,000g ,4,60min, 5.取上清至新1.5ml管,-80储存 (二) 蛋白含量的测定 1、 从-20取出1mg/mlBSA,室温融化后,备用。 2、 取7个5ml离心管,分别加入
10、1mg/mlBSA:0、10、20、40、60、80、100ul,用蒸馏水补足各管至100ul。 3、样本取5ul,加蒸馏水95ul,使总量亦为100ul,混匀。 4、各管加G-250溶液2ml混匀,室温静止2分钟。 5、混匀后,在生物分光光度计上比色分析,测定595nm的光吸收,测定时浓度由低到高。6、于Excel根据标准品绘制标准曲线,根据得出的公式计算样本浓度。 (三) SDSPAGE电泳 (1) 清洗玻璃板:一只手扣紧玻璃板,另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。 (2) 灌胶与上样 1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备
11、灌胶。 (可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽的左、右和下部封边) 2、 按前面方法配10下层胶(15ml,两块胶,每块胶在6.5 ml左右),加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。 灌胶后胶上加一层正丁醇(1ml左右),液封后的胶凝的更快。 3、 当水和胶之间有一条折射线时,说明胶已凝了。弃去正丁醇,用水冲洗,并用吸水纸将水吸干。 4、 等待胶凝期间可计算含50-100ug蛋白的溶液体积即为上样量(根据自己的实验需要进行选择,没有固定的量),目的蛋白GluT3一般在20-30l左右。取出上样样品至200l的EP管中,加入4上样缓冲液及DTT至终浓度均为1(上样总体积一般不超过30l)。上样前要将样品于沸
12、水中煮5-10min使蛋白变性(亦可以使用PCR仪进行变性,加快速度,这样就不用将水煮沸了)。5、 按前面方法配5的上层胶(6ml,两块胶),加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中(从梳子的一头开始插)。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小(也提示胶已经凝固),从而使加样孔的上样体积减小,所以在上层胶凝固的过程中要在两边补胶(不补胶问题也不大)。等待上层胶凝固期间配制1电泳缓冲液。6、加入1电泳缓冲液,两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。 *电泳缓冲液一定要加至超过玻璃板的上缘(量要足够
13、多),否则电泳期间会出现电流过低的现象,进而影响电泳的效果。7、上样 (注意:最外两泳道易跑歪,尽量不用。) Marker 6l (Marker加在最边上的加样孔中) 样本 20-30l 实验所用Marker电泳后出现10条带:10,15,25,35,40,55,70,100,130,170KDa(3) 电泳:电压100V,电流300mA,功率50W,时间1.5hour。(电泳15分钟后可调节电压到130V)电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳,进行转膜(一般要让目的条带跑过分离胶的1/3比较好)。 电泳结束前20分钟配制1X转膜缓冲液。(四) 转膜 (1) 转一张膜需准备4张滤纸和1张硝酸纤维素膜。 切滤纸和膜时一定要戴手套(因为手上的蛋白会污染膜)。将切好的硝