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1、酶联免疫斑点技术介绍一、ELISPOT技术概述1. 技术原理和技术特点ELISPOT全名为酶联免疫斑点检测，英文：（Enzyme-linked Immunospot Assay）。它结合 了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的 分泌情况。其技术原理，一句话概括就是：用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以 酶联斑点显色的方式将其表现出来（Sedgwick JD 2005）。该技术检测细胞因子具有三大优点：其一，灵敏度高。在一百万个阴性细胞中只要有一个分 泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。这是目前为止，最为灵敏的检测技术，灵敏度比传 统的的ELI
2、SA方法高2-3个数量级。其二，单细胞水平，活细胞功能检测ELISPOT检测的 是单个细胞分泌，而非细胞群体的平均分泌。在检测的过程中，有活细胞培养与抗原刺激阶 段，检测的是活细胞的功能，而非死细胞的遗留物。其三，操作简便经济，可以进行高筒量 筛选。ELISPOT没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验 仪器设备。按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样品，效率远远高于其 它检测方法（Kalyuzhny AE 2005）。实验设计在96孔培养板上进行，直接以培养板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纤维素膜为 基质，包被上特异性的单克隆抗体，用以捕获细胞分泌的
3、细胞因子。（由于涉及到细胞培养 的过程，对单克隆抗体的要求要远高于ELISA中的捕获抗体，该抗体需要无毒，不含内毒素， 亲和力高等特点。）之后，在培养板的孔内加入细胞培养基（现在无血清ELISPOT技术已经 成熟，培养基中可以不再含有血清）、待检测的细胞以及抗原刺激物进行培养。在特异性的抗原或者非特异性的有丝分裂原的刺激下，数小时之内，T细胞就会开始分泌各 种细胞因子。细胞因子当即就被位于细胞下方的膜上的单克隆抗体所捕获。在洗去细胞之后， 被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合，然后用酶标亲和素再与生物素结合， 进行化学酶联显色，就可以在膜的局部形成一个个圆形的斑点。每一个斑点就对应了
4、当初一 个分泌细胞因子的细胞，这些细胞被称为斑点形成细胞（Spots forming cells SFCs）。统 计膜上的斑点的数目，再除以当初加入孔内的细胞总数，就可以计算出阳性细胞的频率。其 实验原理如下所示：1. 特异性的单克隆抗体包被在培养板的孔底部；2.封闭所能结合单瓣的其他部位；3.加入细 胞及以及刺激物培养，阳性细胞分泌细胞因子，被细胞下方的单克隆抗体捕获；4.移出细胞， 洗涤；5.加入生物素标记的第二抗体（和双抗体夹心法ELISA类似）；6.加入酶标链霉亲和 素；7加入显色底物，在酶的催化分解下，产生不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成 斑点；8.斑点计数（可以人工计数，也可
5、以使用自动的读板仪来计数），数据处理，结果分 析。2. ELISPOT的发展历史ELISPOT方法从创立至今已经有20多年的历史了。1983年，在地球南北两个半球地理位置 相距遥远的两个研究小组几乎同时、独立的创立了这项技术。一个研究小组位于澳大利亚西 部的柏斯Peth，牵头人是当时正在当地Margaret女王医院儿童医学研究所攻读博士学位的 Jonathon D. Sedgwich (Sedgwick JD et. al., 198)。另一个研究小组位于北欧瑞典城 市哥德堡Gothenburg，带头人是哥德堡大学医学微生物系的学者 Cecil C. Czerkinsky (Czerkinsk
6、y CC et. al., 1983a)。前者开创ELISPOT方法是为了研究B淋巴细胞分泌 IgM 抗体的情况(Holt PG et. al., 1984； Sedgwick JD et. al., 1984)；而后者除了用 于研究B淋巴细胞分泌抗体的情况(Czerkinsky CC et. al., 1983b; 1983c)，还应用于 大肠杆菌分泌肠毒素(Czerkinsky CC et.al., 1983a)和成纤维细胞分泌纤维连接蛋白 (Czerkinsky CC et. al., 1984)的研究中。虽然研究的对象不一样，但是该实验技术所 涉及的原理以及方法步骤和我们现在的标准EL
7、ISPOT几乎完全相同。这二十多年来，ELISPOT基本技术并没有什么重大变化，但是技术进步一直没有停顿，实验 材料的改进了，实验灵敏度与重复性提高了，实验应用领域也拓宽了。1) 底板材质的改进ELISPOT技术从创立之初，检测底板都是使用的普通塑料板，它的蛋白吸附能力差，因此实 验的灵敏度有限。1985年，Moller SA和Borrebaeck CA将膜板引入ELISPOT中(Moller SA et. al., 1985)，检测的也是分泌抗体的阳性B细胞。他们引入的是硝酸纤维素膜，获得 了远远优于塑料板的结果。1995年，荷兰Utrecht大学免疫研究所的Schielen P团队(该 团
8、队后来挂靠Utrecht大学，创办了荷兰U-Cytech公司，成为世界上顶级的ELISPOT试剂 盒生产商之一)把一种更优于硝酸纤维素膜的PVDF膜也被引入了 ELISPOT检测中(Schielen P et. al., 1995)。做过Westernblot的人都知道，PVDF膜比硝酸纤维素膜有更优的蛋白 吸附性质，更加精细的显色条带分辨率。因此，PVDF的引入是继硝酸纤维素膜之后，ELISPOT 底板材料的又一次重大突破(McCutcheon M et. al., 1997)。至今，PVDF膜几乎完全取 代了 NC 膜(Weiss AJ 2005)。“反者道之动”。塑料板在被膜板取代之后，
9、沉寂了许多年，现在又开始兴旺起来了 (Ronnelid J et. al., 1997; Okamoto Y et. al., 1997)。最著名的塑料 ELISPOT 板当 数荷兰U-Cytech公司研发的透明板，已经成为了该公司的一大特色。塑料ELISPOT板的重 新兴旺有两个方面的原因：一方面是技术进步，在塑料材质的改进之后，板底吸附蛋白的能 力已经比传统的塑料板有了很大提高，虽然还赶不上膜板，但是应付ELISPOT实验已经绰绰 有余。更高质量的抗体也有利于塑料板获得更好的ELISPOT结果。另一方面归因于塑料板自 身的优势，相对低廉的价格，简化的操作步骤，简短的实验时间都是塑料板的优势
10、(Ronnelid J et. al., 1997)。此外对于透明板，还可以在实验中随时观察细胞的状态与密度，这对 新手是很重要的。2) 检测内容的多样化在ELISPOT技术创立之初，主要用于检测B淋巴细胞分泌的抗体，包括各种类型的免疫球蛋 白，包被的材料是特异性的抗原或者抗体的抗体(Holt PGet. al., 1984； Sedgwick JD et. al., 1984)。B细胞分泌的抗体一般的量比较大，容易检测，即使早期ELISPOT检测的灵 敏度不够高，检测大量分泌的抗体还是不成问题的(Bjorkander J et. al., 1991; Ahlfors E et. al., 1
11、991; Holmgren J et. al., 1992a)。时至今日，ELISPOT 检测还广泛地用来 研究粘膜免疫中的抗体分泌情况(HolmgrenJet. al., 2005)。后来随着技术的进步，ELISPOT 检测的灵敏度有了大幅度的提高，以至于可以检测到痕量的细胞因子，于是它的主要应用就 转移到检测细胞因子上来 7(Czerkinsky C et.al,. 1988a; 1991; Hutchings PR et. al., 1989)。现在各种常见细胞因子的检测都有了商业化的试剂盒，使用起来非常方面。能商业 化检测的细胞因子包括人类、小鼠、大鼠、猴子、猩猩的干扰素(Y-IFN)
12、、白介素(IL-2， 4, 5, 6, 10，12等)、颗粒酶(GranzymeB)、肿瘤坏死因子(TNF-a)。目前全球ELISPOT 试剂盒的主要供应商有：荷兰U-CyTech公司、瑞典Mebtech公司、法国Diaclone公司、美 国BD Pharmingen公司和R&D公司。他们的产品各有特点，其中荷兰U-CyTech公司的产品 质优价廉，在国内市场居于主导地位。3) 多细胞因子的检测通常的ELISPOT检测每个孔只检测一种细胞因子。如果要在一个ELISPOT孔内同时检测两种 或者两种以上的细胞因子，可以包被两种抗体以捕获两种细胞因子，然后用两种不同的酶联 抗体以及显色剂显出两种斑点
13、来。早在1988年，Cecil C. Czerkinsky就提出并且实现了 这种想法(Czerkinsky C et.al,. 1988b)。但是，双色ELISPOT有一个与生俱来的弱点， 那就是斑点分离的问题。大家知道，斑点的混合色属于物理学上“颜料的三原色”问题，两 种不同颜色的颜料如果以不同的比例混合，会出现一系列不同的表观颜色。其中的细微差异， 人的肉眼有时候都难于判断，何况是自动的读板仪。所以，在双色ELISPOT斑点识别上，总 会有些混色的斑点无法正确的识别与分类。为了解决这个难题，人们想到了用荧光元及检测 ELISPOT 的方法(Ruedl C et. al., 1994; Sa
14、rawar SR et. al., 1994)。不同颜色的荧 光混合在一起，只要加一张滤光片，就可以精确的滤出目标荧光，而遮蔽掉其它颜色的荧光， 荧光之间可以互不干扰。这对于双因子，甚至多因子ELISPOT检测都是十分理想的手段 (Gazagne A et. al., 2005)。但是荧光ELISPOT检测目前还有不足之处。由于荧光素直 接偶联在抗体或者亲和素上，缺乏酶催化底物的那种放大作用，所以灵敏度还无法和化学显 色的ELISPOT方法比较(Gazagne A et. al., 2005)。此外，硝酸纤维素膜自身在激发下 就会发荧光，所以不适合做荧光ELISPOT底板材料。PVDF膜也有自
15、身发荧光的问题，虽然 不像硝酸纤维素膜那样严重，但是也会造成背景升高，信噪比下降的问题(Gazagne A et. al., 2005)。荷兰U-Cytech公司已经发开出了新一代的荧光底板介质Hydrogel，它既有很高 的抗体吸附性质，又没有荧光背景Hydrogel目前存在的唯一问题是保存起来不够稳定， 限制了它的推广。综上所述，多细胞因子检测是ELISPOT未来的一个发展方向，但在技术上 还不够成熟，有待于改进。二、ELISPOT的方法由于有商品化的试剂盒，ELISPOT操作本身已经大大简化。目前的ELISPOT试剂盒按抗体的 包被情况分为已包被板的和未包被板的两类。前者实验操作简单，但
16、是背景较高，且价格较 贵，所以应用不如后者广泛。按照ELISPOT底板材料分，可以分为PVDF膜板和非PVDF膜板。PVDF板由于疏水性的问题，需要用乙醇预先润湿，在洗涤过程中也更复杂一些。各个公司 的试剂盒使用起来大同小异，我们以荷兰U-Cytech公司的PVDF板IFN-y试剂盒威力，列 出其操作方法。1. 实验的准给工作1) 设备与耗材：1. 超净工作台；2. 5% CO2 37C细胞培养箱；3. P20, P200, P1000 微量移液器；4. P300 8通道微量移液器，P300 12通道微量移液器；5. Biosys ELISPOT Reader6. P20, P200, P1000 枪头；7. 多道移液器吸槽；8. 0.5mL, 1.5mL EP 管。2) 溶液配制PBS:人用分析纯试剂，Millipore级别的纯水配制，高压灭菌。PBST: PBS加入0.05%人Tween-20，注意无菌操作。储存于20-25C，可存放一
