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1、损的方法CO Comet Assay专业彗星试验图像分析软件，提供专业快速的测量方法。O 测量指标包括头半径，尾长度，积分光密度，头/尾DNA含量比例，尾矩，Olive 矩等多种参数。 具有自动或手动调节分割彗星头部和尾部功能。同时提供对双染色系统的分析。系统可广泛用于环境毒理学中对DNAM有损伤作用的分析：如紫外光、电离辐射、氧自由基等因素造成的DNAg伤。以及细胞凋亡，抗癌药物的药物毒理学研究，遗传毒理研究和肿瘤治疗的跟踪监Comet Assay彗星分析系统O 彗星试验-单细胞凝月电泳Single cell gel electrophoresis是一种快捷、高灵敏度的检测DNA受测等单细胞
2、凝胶电泳( 彗星试验): 原理、应用和局限性彗星试验：原理、应用和局限性1. 前言过去十年中，彗星试验或单细胞凝胶电泳(SCGE)已成为一个评定DNA损伤的标准方法，广泛应用于遗传毒性试验、人类生物监测和分子流行病学、生态毒理学以及DNA 损伤修复的根底研究，且因其简单、灵敏、多功能、快速、经济实用而赢得了广阔科研工作者的青睐，和其有关的文献数目逐年上升。在应用彗星试验时不会过多去考虑它如何运作和它提供何种信息，因为它在论证DNA 损伤中的成功已足以证明它的价值。这一点实在太可惜，因为它不仅能告诉我们细胞内存在的损伤的类型，而且能告诉我们损伤的程度。尽管彗星试验是检测DNA 断裂的根本方法，但
3、由于对特异性核酸内切酶损伤的引入使其可以检测紫外线诱导的嘧啶二聚体，氧化碱基和烷基化损伤。2. 检测原理和检测指标2.1 背景二十世纪七十年代，Peter Cook 和其同事们制定了一种用非离子去污剂使细胞溶解来研究核结构的方法。这种处理除去胞膜、胞质和核质，并使核小体破裂(几乎所有的组蛋白均被浓盐提取)，剩下的就是由核基质或RNA蛋白质组成的支架以及DN厮构成的类核，其DNA勺双螺旋以核小体的组蛋白为核心形成负超螺旋结构。超螺旋的存在使DNM能自由旋转，Cook等提出一个模型，DNA句断 的附加于基质，有效的形成一系列环状、而不是线性分子。当参加嵌入剂溴乙锭时，负超螺旋松散，环状结构从类核核
4、心伸展开来，形成一个晕圈。同样，用电离辐射来破坏环状结构时可发现相似的效应，单链断裂就足以使超螺旋松散。彗星试验最常用的形式是细胞被包埋于琼脂糖中后，用去污剂和浓盐溶解，这样DNA就被固定，用于继后的电泳。彗星试验最早由Ostling和Johanson阐述，他们参考Cook等的类核模型，用松散的超螺旋的 DNA寸彗星尾巴加以描述，事 实上，彗星尾巴可被简单的看作被电场拉向一边的晕圈。Ostling和Johanson采用低于10的PH值。值得一提的是，尽管我们现在采用最多的是碱性 SCGE对 于检测单链断裂，并不需要在高 PH下进行。2.2 常用的彗星试验形式2.2.1 碱性单细胞凝胶电泳Ost
5、ling和Johanson的试验方法并没有被广泛采用。几年以后，两个研究组独立 的提出了包括在高PH 下处理的方法，Singh 等在 PH 为 10的情况下用2.5M NaCl、Triton-100和十二烷基肌氨酸钠溶解细胞1h,然后用碱(0.3M NaOH)处理， 在高PH (13)的情况下电泳。Olive等在电泳前用弱碱(0.03M NaOH)溶解细胞1ho于是，彗星试验被看作是和碱性解旋、碱性洗脱、碱性蔗糖沉降同类，为了把 DNA 断裂暴露出来，都必需用碱性变性来把DNA 双链同 DNA 断链区分开来。用碱是使彗星尾巴更显著，在不影响其灵敏度的情况下提高检测的分辨率。Ostling和Jo
6、hanson利用这种方法，检测了从1Gy到3 Gy之间的电离辐射的效应, Singh 等报告在0.25 到 3 Gy 范围内彗星尾长增加。2.2.2 中性单细胞凝胶电泳在上述方法发现后，用中性方法检测低水平DNA 断裂能力的另外一种方法被提出。 在一段时间的碱性处理后，恢复条件至中性后再电泳。这一改变降低了其敏感性，扩宽了其应用范围，但仍用于检测单链断裂。为了能排除单链断裂的干扰方便的检测双链断裂，Olive 等提出了一种完全不同的中性彗星试验。他们的方法采用了在50的琼脂糖长时间处理溶解细胞，在这种情况下核基质可能被破坏，从而真正的观察DN/W链断片或这些断片的游离末端。2.2.3 对损伤特
7、异酶类的使用检测 DNA 断链只能给出有限的信息。一些损伤剂可能直接引起DNA 断裂，但通常它们会很快重新连接起来。事实上它们可能只是脱嘌呤/脱嘧啶位点即AP位点或无碱基糖，因其在碱性条件下不稳定，所以看似断片。他们也可能是细胞内修复的中间产物。因为核苷酸和碱基切除修复过程都是切掉损伤并用正确的碱基予以替换。为了在提高灵敏度的同时提高特异度，我们介绍了用可产生特定损伤或断裂的酶来消化类核的额外步骤。 因此，核酸内切酶田 用于检测氧化的喀 噬，甲酰胺基喀噬 DNA糖基化酶FDG用于检测主要的喋吟氧化产物 8-羟 基鸟喋吟和其它改变了的喋吟 万4核酸内切酶V用于识别UV诱导的环丁烷喀呢 二聚体，A
8、lk A在3-甲基腺喋吟端切割DNA。上述实例中，DNA断裂频率增加 那么彗星尾部强度增加。在过氧化氢处理过或加有光敏剂用可见光处理过的细胞中，用核酸内切酶m或FDG 很容易检测出氧化碱基。这种氧化的碱基在正常人淋巴细胞中也有一定数量的发现。2.3 不太常用的彗星试验形式2.3.1 5溴 -2脱氧尿苷标记检测复制DNA和 DNA 复制有关的DNA 断裂将使彗星尾长增加，然而，用这种方法不可能辨别出 S 期和非S 期细胞可能是因为在某一时间参与复制的DNA 数目极少，或因为复制装置用某种方法稳定复制叉，使这种断裂和正常的损伤断裂不同。如果在复制期间用5澳-2脱氧尿音BDdR来标记细胞，然后用抗5
9、澳-2脱氧尿苷抗体显色，可观察到带有标记的彗尾，后5 溴 -2-脱氧尿苷标记期间DNA 复制的成熟导致标记物质重新进入头部。2.3.2 检测DNA多复的中间物有的断裂可看作UV 诱导损伤或大块加合物时核苷酸切除修复的中间物，此种断裂通常是短命的至少在增殖细胞中是如此。把 UV 照射的细胞和DNA 合成抑制剂羟基脲、阿糖胞苷或阿非迪霉素一起培养，将阻断断片的修复合成，引起剪切断裂的积累，这就提供了一个检测损伤的敏感方法。在非分裂细胞如外周血淋巴细胞，剪切裂口在没有抑制剂时也能积累，因为其再联接的速率受三磷酸脱氧核苷供给缺乏的限制。2.3.3 荧光原位杂交彗星试验彗星的出现反映出细胞内DNA 损伤
10、的总体情况。它对特殊染色体或染色体区域的定位及区分彗星内DNA 或特殊基因的种类非常有用。荧光原位杂交 FISH通常用 cDNA 或寡聚核苷酸探针识别目的基因的序列而到达此目的，但要同包埋在正常杂交温度下溶解的琼脂糖中有彗星微细结构的DNA 杂交，还存在技术困难。目前这些问题已经解决，用它来识别特殊染色体的DNA、端粒DNA、着丝粒 DNA 和单拷贝基因已成为可能。目前用这种方法很少能出现有用的信息尽管图象很漂亮，但还是很有前途的。例如，它可以用于检测低剂量DNA 损伤剂处理后特殊基因的修复速度。2.4 彗星试验能检测凋亡吗？当几乎所有的DNA 都在彗星尾部，就使彗星的头部变小，可以把其想象成
11、一个环状彗星。因为某些原因，有人认为环状彗星代表凋亡细胞。当然，一些损伤相对严重的细胞将经过程序性细胞死亡是完全可能的，但不能被描述成凋亡，有两个理由：l凋亡是不可逆的，但显示为环状彗星的受损细胞可修复它们的损伤，使环状消失。l凋亡的特征是DNAff片变为核小体寡聚体大小，这些小片段 DNA在溶解或电泳过程中肯定会消失；有时可能看见极少正常DN破光的彗星残影，可能代表凋亡细胞中的高分子量 DNA残影.最近 Singh 提出一个观察凋亡细胞的方法，和普通彗星试验一样，把细胞包埋入琼脂糖并溶解，然后并没有电泳，而用乙醇沉淀DNA 来替代。的凋亡诱导剂处理过的细胞显示出粒状DNA 的晕圈和模糊的外边
12、界，如同扩散的小片段显示的一样。2.5 在彗星t验中AP位点是否可被看作 DNA断裂?AP 位点在碱性环境中不稳定，但我们通常在碱性SCGE 中所用的PH 和处理时间足以使它们一局部或全部断裂吗？实验说明，与采用0.03M NaOH 相比，采用强碱 0.3M NaOH 能使更多的AP 位点断裂，并可局部解释较温和的碱性方法较低的灵敏度，但PH 不是唯一的变量，所以很难进行方法之间的直接比拟。用 AP 核酸内切酶来解释这个问题是可能的；在特殊的PH 条件下，用能诱导 DNA 碱基丧失的试剂处理细胞后，用AP 核酸内切酶消化类核能使断裂增加吗？然而，AP 核酸内切酶经常和去除特殊损伤碱基提供AP
13、底物的转葡糖基化酶有关连，也存在着非特异性污染核酶活性的可能性,所以给出一个明确的答案非常困难。用甲基甲磺酸盐处理蚕豆属faba根尖细胞的试当说明有一些 AP核酸内切酶敏感位点在强碱0.3M NaOH条件下并未断裂。3. 彗星的定量3.1 观察彗星用DNA结合染料染色后，在荧光显微镜下可观察DNA,溟乙锭EB最为常用，4, 6-二眯基-2-苯基口引哚 DAPI 次之。EB 是一种嵌入型染料，与DNA 单链相比，能更有效的结合DNA 双链。 DAPI 能与 DNA 双螺旋主沟结合，荧光强度视双链结构而定。碱处理时DNA 链分开， 即使头部完整的超螺旋在中和时易于复性，但至少DNA尾部将会彻底的变
14、为单链。用口丫咤橙 AO染色更肯定这一点。 AO使单链核酸呈现红色荧光，使双链DNA 呈现黄/绿色荧光。我们发现用AO 染色会产生红色的彗星尾巴和明显的黄/绿色彗星头。 那么我们用EB 和 DAPI 可以观察到什么呢？起码和DNA 双链相比，DNA 单链的强度要小一些，所以，尾部DNA 所占的百分比越高，整个彗星所能检测出的荧光就越少。我们用DAPI 测量过，发现总荧光量几乎未减少Fig.1 。对从被更为有效染色的DNA 双链中去掉的头部中被浓密包裹的DNA 来说，或许有一种偶然的代偿和荧光的自淬灭。无论是什么原因，我们都可以从彗星中获得更多的信息。总荧光量反映出 DNA 含量，与G1 期细胞
15、相比，G2 期细胞能使彗星荧光量增加。因此，细胞群中每个彗星的损伤水平可以和细胞周期联系起来。实际上,彗星实验和流式细胞仪一样，均和DNA 含量有关。3.2 彗星测量：图象分析有很多能计算彗星荧光参数的软件包可供选择。最重要的参数是尾长，头尾光密度比通常以尾部DNA所占百分比表示和尾矩。尾长非常有用，因其只在相对低的损伤水平增加。随后损伤剂量增加时，尾部光密度增加，而尾长不变。因尾部的终点由设定的超出背景的荧光值决定，所以尾长也对图象分析系统所设定的背景或阈值很敏感。相对来说，尾部光密度是最为有用的参数，因其与损伤频率成线性关系，受阈值设定的影响较小，并在最大范围内分辨损伤理论上，尾部DNA 从 0%-100%。同时，它也可给出判断彗星实际外观的明确指标。相比之下，第三个参数尾矩根本上是尾长与尾光密度的产物与损伤剂量没有
