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1、粗多糖测定方法第一法本方法参照保健食品功效成分检测方法（王光亚、白鸿主编）中“粗多糖的苯酚- 硫酸分光光度测定法”的方法测定。1. 主要仪器（1）离心机：4000r/min（2）离心管：50ml（3）分光光度计（4）水浴锅（5）漩涡混合器2. 试剂实验用水为双蒸水，所用试剂为分析纯级。（1）无水乙醇（2）80%（V/V）乙醇溶液（3）葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的分析葡萄糖0.5000g加水溶解，并定容至50ml， 此溶液lml含10mg葡萄糖，用前稀释100倍为使用液（O.lmg/ml）。（4）5%苯酚溶液（W/V）:称取精制苯酚5.0g,加水溶解并稀释至100ml，混匀。溶液置于 冰箱
2、中可保存一个月。（5）浓硫酸（比重1.84）。（6）0.2mol/L 磷酸盐缓冲液（pH6.5）： 31.5ml（0.2mol/L）磷酸氢二钠与 68.5ml（0.2mol/L） 磷酸二氢钠混合。3. 测定步骤（1）样品提取：称取混合均匀的固体样品1.02.0g，置于100ml容量瓶中，加水80ml左 右，于沸水浴中加热1小时，冷却至室温后补加水至刻度（Vi）0取50ml上述提取液置于 100ml具塞锥形瓶中，加lml 10%淀粉酶液和0.5ml 0.2M磷酸盐缓冲液，加塞，置55C60C 酶解1小时，再加约为样品体积1%的葡萄糖苷酶于60C以下再水解1小时候取出（用碘液 检验是否水解完全，如
3、不完全可延长水解时间至酶解液加碘液不变蓝色为止），于电炉上小 心加热至沸腾做灭酶处理，冷却至室温，定容至100ml,过滤，取滤液沉淀粗多糖。（2）沉淀粗多糖：准确吸取上述滤液5.0ml （V2），置于50ml离心管中，加入无水乙醇20ml， 混匀，与4C冰箱静置4小时以上，以4000r/min离心5min,弃去上清液，残渣用80%（V/V） 乙醇数毫升洗涤，离心后弃去上清液，反复操作3次。残渣用水溶解并定容至1025ml （V3）（根据糖浓度而定），供测定用。（3）标准曲线的绘制：准确吸取葡萄糖标准使用液0ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、 1.00ml （相当于葡
4、萄糖 Omg、O.Olmg、0.02mg、0.04mg、0， 06mg、0.08mg、O.lOmg）置于 25ml比色管中，补加水至2.0ml，加入5%苯酚溶液1.0ml，在旋涡混合器上混匀，小心加入 浓硫酸10ml，在旋涡混合器上小心混匀，置沸水浴中2min，冷却至室温，用分光光度计在 485nm波长处以试剂空白为参比，1cm比色皿测定吸光度值。以葡萄糖质量为横坐标，吸光 度值为纵坐标，绘制标准曲线。（4）样品测定：准确吸取样品测定液适量（V ）（含糖0.020.08mg）置于25ml比色管中，4补加水至2.0ml，然后按（3）法测定吸光度值。从标准曲线上查出葡萄糖含量，计算样品 中粗多糖含
5、量。4结果计算mHX= X 0.9 X 100m? 式中X样品中粗多糖含量mg/100g（ml）；m1样品测定液中葡萄糖的质量（mg）；m2样品质量（g或ml）；V样品提取液总体积（ml）；V?沉淀粗多糖所用样品提取液体积（ml）；V3粗多糖溶液体积（ml）；V4测定用样品液体积（ml ）；0.9葡萄糖换算为粗多糖的系数。第二法按保健食品功效成分检测方法（王光亚、白鸿主编）中“葡聚糖的分光光度测定法” 的方法测定。本方法适用于各类食品中以葡聚糖为主要结构，相对分子质量10000以上的水 溶性粗多糖的测定。本法最低检出限为5.0mg/L。5. 方法提要食品中相对分子质量大于1X104的高分子物质
6、在80%乙醇溶液中沉淀，与水溶液中单糖 和低聚糖分离，用碱性二价铜试剂选择性地从其他高分子物质中沉淀具有葡聚糖结构的多 糖，用苯酚一硫酸反应以碳水化合物形式比色测定其含量，其显色强度与粗多糖中葡聚糖的 含量成正比，以此计算食品中粗多糖的含量。6. 主要仪器1）分光光度计2）离心机（3000r/min）3）旋涡混合器7. 试剂本方法所用试剂除特殊注明外，均为分析纯；所用水为去离子水或同等纯度蒸馏水。1）乙醇溶液（80%）： 200ml水中加入无水乙醇80ml，混匀。2）氢氧化钠溶液（100g/L）:称取100g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1L。加入固体无水硫酸钠至饱和，备用。3）铜试剂储备液：称取
7、3.0g五水硫酸铜，30.0g枸橼酸钠，加水溶解并稀释至1L,混匀， 备用。4）铜试剂溶液：取铜试剂储备液50ml，加水50ml，混匀后加入固体无水硫酸钠12.5g 并使其溶解。临用新配。5）洗涤剂：取水50ml，加入10ml铜试剂溶液、50ml氢氧化钠溶液，混匀。6）硫酸溶液（10%）:取100ml浓硫酸加入到800ml左右水中，混匀，冷却后稀释至1L。7）苯酚溶液（50g/L）:称取精制苯酚5.0g，加水溶解并稀释至100ml,混匀。溶液置 冰箱中可保存一个月。8）葡聚糖标准储备液：准确称取相对分子质量5X105已干燥至恒重的葡聚糖标准品 0.5000g，加水溶解，并定容至50ml，混匀，
8、置冰箱中保存。此溶液1ml含10.0mg葡聚糖。9）葡聚糖标准使用液：吸取葡聚糖标准储备液1.0ml，置于100ml容量瓶中，加水至刻 度，混匀，置冰箱中保存。此溶液lml含葡聚糖O.lOmg。&测定步骤8.1样品处理8.1.1样品提取：称取混合均匀的固体样品2.0g，置于100m l容量瓶中，加水80m l左右， 于沸水浴上加热2小时、冷却至室温后补加水至刻度，混匀后过滤，弃去初滤液，收集余下 滤液供沉淀多糖。8.1.2沉淀粗多糖：准确吸取样品提取中终滤液5.0ml或液体样品5.0ml,置于50ml离心 管中，加入无水乙醇20ml，混匀5min后，以3000r/min离心5min,弃去上清液
9、。残渣用80%(体 积分数)乙醇溶液数毫升洗涤，离心后弃上清液，反复操作3-4次。残渣用水溶解并定容至 5.0ml，混匀后供沉淀葡聚糖。8.1.3沉淀葡聚糖:准确吸取沉淀粗多糖后的终溶液2ml，置于20ml离心管中，加入100g/l 氢氧化钠溶液2.0ml、铜试剂溶液2.0ml，沸水浴中煮沸2min,冷却，以3000r/min离心5min, 弃去上清液。残渣用洗涤液数毫升洗涤，离心后弃去上清液，反复操作次，残渣用10% (体 积分数)硫酸溶液2.0m l溶解并转移至50ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。此溶液为样 品测定液。8.2标准曲线的绘制：准确吸取葡聚糖标准使用液0ml、0.10ml、
10、0.20ml、0.40ml、0.60ml、 0.80ml、1.0ml (相当于葡聚糖0mg、0.01mg、0.02mg、0.04mg、0.06mg、0.08mg、0.10mg), 分别置于25ml比色管中，准确补充水至2.0ml，加入50g/L苯酚溶液1.0ml,在旋涡混合器上 混匀，小心加入浓硫酸10.0ml,于旋涡混合器上小心混匀，置沸水浴中煮沸2min，冷却后用 分光光度计在485nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度值。以葡聚糖浓度 为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。8.3样品测定:准确吸取样品测定液2.0mL,置于25mL比色管中，加入50g/L苯酚溶液1.0
11、mL, 在旋涡混合器上混匀，小心加入浓硫酸10.0mL，在旋涡混合器上小心混匀，至沸水浴中2min, 冷却至室温，用分光光度计在485nm波长处以试剂空白为参比，1cm比色皿测定吸光度值。从 标准曲线上查出葡聚糖含量，计算样品中粗多糖含量。同时做样品空白试验。9. 结果计算(mm) XV XV XV12135x=-m XV XV XV3246式中X样品中粗多糖含量(以葡聚糖计)(mg/g)m1样品测定液中葡聚糖的质量(mg)m2样品空白液中葡聚糖的质量(mg)m3样品质量(g)V样品提取液总体积(ml)V沉淀粗多糖所用样品提取液体积(ml)V粗多糖溶液体积(ml)V3沉淀葡聚糖所以粗多糖溶液体
12、积(ml)4V样品测定液总体积(ml)5V测定用样品测定溶液体积(ml)610. 准确度与精密度在不同食品中进行不同浓度的加标回收实验，回收率为87.8%110.87%,不同实验室对 同一样品进行10次测定结果的相对标准偏差为5.8%。11. 注意事项本方法测定的水溶性多糖含有10个以上单糖残基。在测定过程中应避免糖和其他碳水化合物的污染，因为苯酚一硫酸与糖和碳水化合物起反应。某些保健食品中功效成分为醇溶性多糖，可参照本方法进行测定，但样品预处理时将乙醇改为丙酮即 可。洗涤粗多糖沉淀时，一定要将离心管壁上玷污的其他糖分和碳水化合物用80%乙醇洗净，否则结果偏高。 此法适用于测定高分子量的糖类物
13、质（10000Da）。低聚木糖的测定1. 试剂（1）4mol/L硫酸：98%硫酸用水稀释而成，并标定校准浓度；（2）40%氢氧化钠：取40.0g氢氧化钠，加入100ml水溶解即可；（3）无水乙醇（AR）；（4）乙腈（色普级）；（5）0.45pm水相过滤膜。2. 仪器及色谱条件（1）仪器高压液相系统（515高压泵、7725进样阀、柱温箱、2414示差折光检测器、色谱工作 站），真空泵或电吹风。（2）色谱条件色谱柱：Waters Carbohydrate High Performance 4pm 4.6X 250mm Cartridge流动相：乙腈：水=75： 25 （V/V）；流速：l.Oml/
14、min；柱温：35C；示差检测器温度：35C。进样量：20.0pl3样品处理（1）取约1.0g样品于50.0ml小烧杯中，加10.0ml水溶解样品，并转入50.0ml容量瓶中， 再加水5.0ml洗涤烧杯并全部转入容量瓶中，最后用无水乙醇定容至刻度，摇匀离心（4000r/min, 10min），取上清液15.0ml于小烧杯中用电吹风（不大于50C ）吹赶尽乙醇, 用水溶解定容至15.0ml。（该溶液为样品水解前上机测定溶液M1）（2）取10.0ml于水解管中，加入4mol/L硫酸1.80ml,摇匀，于100C水解2小时，冷却; 用40%氢氧化钠中和（pH值5-7），加水定容至25.0ml的容量瓶
15、中，摇匀，取上清液2.0ml, 用无水乙醇定容至10.0ml刻度摇匀离心，取上清液8.0ml于小烧杯中，电吹风吹干；加水 溶解，定容2.0ml,用0.45pm水相膜过滤。（该溶液为样品水解后上机测定溶液M?）。4上机测定样品的体积：V （ml） =50mlV2 （ml） =156.25ml5.计算标准样品：取纯度为99.5%木糖75.0mg于25.0ml容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀， 制成3.0mg/ml木糖标准品溶液，备用。低聚木糖含量X （%，以木糖计）=m2-MM :样品水解前低聚木糖含量（%）； =Aspl/As tdXCs tdXV X10-3/WX100M2：样品水解后低聚木糖含量（%）； =Aspl/As tdXCs tdXV? X10-3/WX100Aspl：样品中木糖组分峰面积；Astd：标样木糖组分峰面积；Cstd：标样木糖组分浓度（mg/ml）；V：水解前稀释体积（ml）；V：水解后稀释体积（ml）；W：样品重量（g）计算结果保留两位有效数字淫羊藿苷的测
