表达载体转化的方法

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1、目前外源基因导入叶绿体基因组的方法主要有基因枪转化法、PEG介导转 化法、显微注射及激光注射法、转运肤介导的叶绿体间接转化法、电击法等。(1) 基因枪转化法基因枪法是20世纪80年代后期发明的，它是将外源DNA(通常是带有目 的基因的质粒载体)如附在金属颗粒(如钨、金等)表面，然后通过高压动力装 置将金属颗粒轰击到受体细胞中的特定部位。基因枪法是目前己被验证的叶绿 体基因组转化转化效率最高、采用最多的方法。大多数己经成功的叶绿体基 因组转化都是用这种方法实现的。它可以通过人为控制，将外源DNA导入到 细胞核及细胞器(如叶绿体体、线粒体等部位)中。基因枪法不受物种和基因型 的限制，转化后的组织可

2、以迅速再生成植株，并且这一方法适合于不同种类的 植物，其缺点是成本较高，操作复杂，不易普及到所有实验室。(2) PEG介导转化法PEG介导转化法是在PEG存在的情况下将去壁的受体细胞原生质体暴露 在纯化过的外源DNA中，由于PEG的存在，原生质体会先缩水，然后细胞膜 结构会发生重构，在细胞膜结构到达不可逆破坏之前除去PEG,细胞膜结构又 会回复到原先的自然稳定状态。在此过程中，外源DNA有机会进入胞内及质 体内，从而实现外源基因的转化。Golds等用PEG介导转化法成功地实现了烟草 的原生质体转化，为质体转化提供了一条新的途径。该方法虽然成本较低，但原 生质体的制备和再生比较困难，使得转化植株

3、的再生频率较低，从而限制了这一 方法的普遍应用。到目前为止，只有PEG法在烟草质体转化中获得成功的报道。(3) 显微注射及激光注射法显微注射及激光注射法就是利用能量很高、直径很小的激光微束引起细胞膜 可逆性穿孔，从而使处于细胞周围的外源DNA随之进入细胞的转基因方法。早 在1987年，webe等就利用微束激光照射油菜细胞，将用荧光素标记的外源DNA 导入叶绿体，观察到荧光显示，并且发现这一处理对叶绿体的光合能力和细胞的 分裂能力影响较小。由于激光微束穿刺技术操作简便，转化频率高，从而引起了 许多科学家的重视，由此带动了此项技术在原生质体遗传转化中的应用与发展。 此后，Kllobfauch等研究

4、开发出了一种称为“毫微注射技术”(几 mtojeetionteehnique)的叶绿体基因组转化方法。该方法是用一种亚显微直径为O.lrnrn 的微型注射器(femtosyringe)将 10 一 15 几(fL,femtoliter)的外源 DNA 直接 导入完整植物细胞的叶绿体中。此种注射器是根据锢(indium,In)、稼(gaHium,Ga)、 和锡(tin,sn)组成的液态合金“gahnstan”的热膨胀原理制造的。由于这种合金具有 很好的热传导性，热诱导的galinstan膨胀可以很好地控制注射速率，注射器不 会对叶绿体细胞器造成明显的损伤。激光微束穿刺法对细胞的损伤小而且操作简

5、便，可以准确定位于被照射的细胞，实验重复性好，己成为一种行之有效的转基 因手段。但与农杆菌介导法相比，激光微束穿刺法转化效率较低，且激光微束仪 设备复杂造价昂贵，因此限制了此技术的推广普及。(4) 转运肤介导的叶绿体间接转化法此方法的原理是在构建植物定点整合表达载体时，将外源基因和叶绿体的 转运肤编码序列相连，然后用细胞核转化技术把外源基因导入植物细胞。这样 外源基因编码的蛋白质就有可能在转运肤的引导下输送到叶绿体细胞器中去，从 而克服叶绿体DNA多拷贝的问题，并且在很大程度上还可缓解转化体的分离。 例如Bogoradl将PsbA同转运肤序列融合后，通过Ti质粒导入烟草的核基因组 后，在细胞质

6、中合成的融合蛋白基因产物在转运肤的作用下输入到叶绿体腔内， 间接地实现了叶绿体的转化。采用转运肤介导目的基因的方法虽然没有将外源基 因整合到叶绿体基因组中，但可以使外源基因的产物蛋白定位到叶绿体中。由于 细胞核转基因技术己经相当成熟，因此，这种间接的采用转运肤介导叶绿体转化 的方法可能是一条值得采用的途径。(5) 电击法电击法是利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上进行“电击穿孔”，形成可逆 的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄入，此法最早是在动物细胞中得到应用， 并取得了很好的效果。现在这一方法已被广泛应用于各种植物，例如Guerche用 纤维素酶处理油菜2周龄的嫩叶后获得原生质体，将原生质体置于

7、电穿孔仪中进 行电击转化处理，筛选得到了 21个抗性克隆，并最终获得了 2株转化植株，其 形态和育性完全正常；黄家总等用电击细胞融合的方法成功地使桂竹香和紫罗兰 的原生质体产生融合。由于该方法对细胞没有毒害作用，融和同步性好，并且操 作简便，整个过程中的参数容易控制，可在显微镜下观察融合的全过程，因此已 被广泛应用于动植物及微生物细胞的融合。电穿孔技术转化三角褐指藻以三角褐指藻为受体细胞，利用电穿孔法将构建好的三角褐指藻叶绿体基因 组定点整合表达载体pRC GFP转化进三角褐指藻叶绿体中，用不同浓度的氯 霉素进行阳性藻株的筛选，扩大培养后在激光扫描共聚焦显微镜下检验绿色荧光 蛋白GFP的表达情

8、况，并提取阳性藻株的总DNA进行CAT基因表达盒的扩增, 进行分子水平的验证。3.1实验材料藻种及质粒三角褐指藻由暨南大学藻种库保存。质粒pPtc 一 GFP为上一章中所构建。3. 1. 2主要实验试剂3-1主要实验试剂 Table 3-1 The li$t of reagents试剂名称级别试剂产地及厂家甘露醇A.R,广州化学试剂厂NaClA.R.广州化学试剂厂氯霉素A.R.Sigma琼脂粉A.R.OXOID无水乙醇分析纯广州化学试剂厂主要培养基和试剂的配制1）f/2（Si 一培养基配制同2.1.42）1%f/2固体培养基的配制:1L f/2液体培养基（不加生长素）加入10g琼脂粉, 高压灭

9、菌后温度降至40C左右时加入生长素。3）100mg.ml-1氯霉素的配制:称量1g氯霉素溶于10ml无水乙醇中，分装后用 锡纸包住。3.2实验方法3.2.1电穿孔法转化三角褐指藻待藻细胞进入对数生长期后，进行电击实验。具体操作步骤如下：1）离心收集l.0xl07 108个藻细胞，1394xg离心10min，弃上清。2）加 150ul 1.0molL-1NaCL 悬浮藻细胞，再加 150ul 0.1molL-1 甘露醇，混匀，冰上放置30min。3) 将藻液转移到0.4cm电激杯内，电激杯内藻液以不超过400 ul为宜，同 时加质粒pPtC-GFp(0.4 ug)混匀。4) 将电激杯放置好，调电

10、穿孔仪电容至25F,电阻为400欧，电压为1.5kv, 进行电击。5) 将电击后的藻液转移到50ml三角瓶中，加新鲜的f/2培养基10ml，暗 处理2h,再正常培养24h(12L:12D)。3.2.2氯霉素筛选阳性藻株并扩大培养收集培养电击后培养了 24h的藻液，155xg离心5min收集藻细胞，用新鲜 的f/2(Si -)培养基悬浮藻细胞，将藻细胞分别涂布于含有氯霉素(200ug.ml-提取扩大培养后的阳性藻株总DNA。具体步骤如2.2.2 以阳性藻株总DNA为模板，利用引物P5、P6扩增氯霉素乙酞转移酶(CAT)表达盒。 片段CAT基因表达盒的PCR反应体系为20ul,取5ul扩增产物与1

11、ul 6xLoadingBuffer混匀后以1%琼脂糖凝胶电泳检查结果, 并拍照。3.3结果与分析阳性藻株经过氯霉素筛选后的生长状况、 300ug.ml-1和400ug.ml-1)的f/2(si-)固体培养基平板上进行筛选。挑取在抗性平板 上长出的转化子藻落，转接于含有相应浓度抗生素的f/2(si 一)液体培养基中扩大 培养。每7天更换一次含相同浓度氯霉素的培养基。氯霉素进行平板筛选的设定如下(表3-3)：3-3氯霉宸活送旳浓良设处Table3-3 The concentration of Chloromycetin氯霉素(pl)f/2培养基(ml)氯霉素浓度(pgml1)4020200实验组

12、602030D8020400对照组40202003.2.4氯霉素乙酞转移酶(CAT)基因表达盒在阳性藻株中的扩增1)平板筛选后长出的藻落将电击后的藻液离心重新悬浮后涂到均匀涂布在含有不同浓度(200ug.m1-i、 300ug.m1-i和40ug.m-i )氯霉素的f/2( Si-)固体培养基上，倒置于智能人工气候箱 中培养，经过10至15天后，对照组在200ug.m1-1氯霉素平板上无可见藻落(图3 一 1A),而实验组在200ug.m1-1、300ug.m 1-1,和400ug.m1-1，氯霉素筛选浓度下可 看到清晰的藻落长出(图3-1B,C,D)。说明200ug.m1-1，,筛选浓度下己经完全可以 抑制藻细胞的生长，而电击后的三角褐指藻对氯霉素产生了抗性。2)阳性藻株在含有氯霉素的培养基中扩大培养从含不同浓度氯霉素的筛选平板上挑出藻落接于同样含有氯霉素的新鲜 f/2液体培养基中扩大培养，经过藻细胞不断分裂后，阳性藻株依然可以在含 有氯霉素的培养基中生长并长势良好(图3-2)。