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1、Primer3在线引物设计攻略开始之前：其实非常简单，不需要你下载任何软件，但是你得有一台电脑能上网。当然，最重要的是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板序列，不再本次讨论范围。另外，要先对PCR目的序列的长度有个大致估计，好了，马上开始吧：第一步：找到Primer3的站点。你不用记住这个站点，但是要记住“Primer3”这个词，然后打开GOOGLE页，输入Primer3,跳出来的第一个项目就是了“Primer3Input0.4.0”，网址是。第二步：贴上模板序列。进入Primer3站点，可以看到一个引物设计的界面。（如下图）在“Pastesourcesequencebelow（5
2、-3”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖进去。注意是5-3方向的，数字或者空格都没关系，软件会自动过滤的。第三步：重要参数设定。首先是“ProductSizeRanges”，如果你不希望软件给你随便做的话，首先要调整的就是这个参数。默认的参数实际上是从100到1000，这个你得自己改，如果你希望产物的大小符合你的预期，尽可能把范围改小，比如480-500，具体看情况调整。第二个参数是“PrimerSize”，默认值一般可以用，但是，当你用熟了这个软件，你自己就知道该怎么改了。第三个参数是“PrimerTm”这个和PrimerSize差不多。第四步：Pickprimers：点一下这个按钮，符合你
3、大小预期的primer就出来了，看看Primer3Output的界面，多么漂亮！你要的primer出来了，而且有primer在序列上的位置比对图，还要primer本身的信息，包括位置，长度，TmGC?量，任何位置互补碱基数，3端互补碱基数，以及引物序列，（注意，下游引物是5-3），还要产物大小，两引物间任意互补碱基数，两引物间3端互补碱基数等。如果引物尚在参数设定的范围内，但还不是最佳，将会给出警告。比如（随便举例，本人在做一个超长引物）：WARNING:Leftprimerisunacceptable:High3stabilityOLIGOstartlentmgc%any3seqLEFTPR
4、IMER33TAATACGACTCACTATAGGGGTGAAAGACTGCCRIGHTAAAGGGTTAATTTGPRIMER138834CATGCTTTATTTACACACATSEQUENCESIZE:1388INCLUDEDREGIONSIZE:1388PRODUCTSIZE:1388,PAIRANYCOMPL:,PAIR3COMPL:第五步：引物设计检验：可以仅仅设计一对引物，只要在Pickleftprimer或者Pickrightprimer前面的勾勾掉一个就可以。也可以自己定义引物，放在Primer框里，（注意，下游引物的书写反向仍然是5-3）如果符合设定的条件，软件将对给出引物评
5、分，同时给出警告信息，根据警告信息可以适当对自定义引物做些调整即可，警告信息也让你做实验的时候心中有数。对于文献发表的引物，最好都要检查一下，这样就可以避免被别人有意无意误导。至于RT-PCR所用的引物，最好是使得产物跨过内含子，这样避免潜在DNA寸RT-PCR勺干扰。实际做引物的时候，要把内含子都去掉，仅仅把外显子序列放入源序列框中，并且通过自定义引物设计的方法，使上下游引物分别全部或者部分落在不同外显子上。至于如何快速识别内含子和外显子以及电子PCR将另做说明。至于设计出来的引物的实际效果，根据我的经验，一般情况下都能做到PCR-次成功，也许随便那一段序列做引物也能达到很好的效果，但是不管怎么说，软件做引物可以让自己心中有数。最后，GOODLUCKTOEVERYONE.
