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1、肿瘤相关突变基因检测试剂（高通量测序法）性能评价通用技术审查指导原则一、前言本指导原则旨在指导注册申请人对肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。本指导原则是针对肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要详细阐明理由，并对其
2、科学合理性进行验证，提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。二、适用范围本指导原则所述肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价主要是指基于高通量测序（high-throughput sequencing）即下一代测序（next generation sequencing, NGS），又称为大规模平行测序（massively parallel sequencing, MPS），体外检测人体组织中肿瘤细胞中肿瘤相关基因变异。用
3、于检测体细胞突变的NGS正在广泛用于肿瘤诊疗相关的分子检测，包括对特定基因的DNA/RNA进行测序，以寻找与肿瘤临床诊疗相关的突变基因的改变。肿瘤基因突变类型包括点突变、插入、缺失、基因重排、拷贝数异常等广义的基因突变。基于NGS测序原理的IVD检测可能包括以下步骤：样本收集，处理和保存、DNA提取、DNA处理、文库制备、测序和碱基识别、序列比对/映射、变异识别和过滤、变异注释和解读以及检测报告的生成。同时，某些产品还可能会包括软件部分，但上述相关步骤并不一定被全部包括，应根据产品的具体设计流程来进行判断。对于每个检测步骤，申请人需要结合产品设计和临床意义来建立特定的可接受的质量评价指标和合格
4、判断标准。此外，为满足产品特定预期用途，申请人需通过科学和适当的检测性能研究来确定适用的试剂，消耗品，仪器和软件。基于上述考虑因素，NGS检测产品的设计和工作流程中的任何差异均可能导致结果的不同，因此申请人需要清楚地描述相关检测性能指标。分析性能评价的初衷在于提出产品性能有效性、安全性相关问题的假设，然后通过研究进行确认。NGS在测序通量及发现未知基因变异方面具有优势，但是在NGS技术应用需求及使用中存在包括相关临床样本收集处理、NGS检测内容、测序流程、数据分析、结果报告、技术质量认证和验证等各方面的挑战。本指导原则将重点关注实体瘤中检测具有临床意义的体细胞变异和确保高质量的测序结果。申请人
5、应以患者的利益为中心，充分整合临床肿瘤学家对于精准诊治的观点，并充分考虑在我国推广应用的可操作性。申请人可采用多样化的靶向基因组合检测。由靶向基因组产生的信息可能会被用于诊断分类，指导治疗决策，和/或为特定肿瘤提供预后评价，不同产品包含的基因数量可能存在较大差异。本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。本指导原则不适用于基于胚系来源检测,全外显子检测，肿瘤突变负荷（TMB）检测，非靶向测序，从头测序、微生物感染辅助诊断、游离DNA检测、直接面向消费者测序、胎儿检测、微生物基因组鉴定和药物耐药性检测、胚胎植入前检测、疾病风险（含遗传风险) 评估与预测、RNA直接测序、筛查、独立
6、诊断目的、肿瘤基因组测序、健康个体测序检测。三、NGS性能评价(一)综述资料综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及同类产品上市情况介绍等内容。 作为IVD检测一般原则，申请人应首先定义申报产品的预期用途和检测性能，产品的预期用途将直接影响检测设计和检测性能以及测序和/或报告的基因类型。申请人需要前瞻性地确定应进行的研究指标（例如准确性）以及每种研究指标应该满足的标准。在设计和开发完成之后，验证研究其是否满足预定义的性能。如果检测不符合任何预定义的性能标准，则应该修改并重新验证。通过反复的设计，开发和验证，直到检测满足设定需求。在整个过程中，申请人需
7、要记录所有研究方案，研究过程和结果，以及每项研究设计的理由。申请人应列出检测样本水平相关参数，建议以列表形式明确，详见附表1申请人应提供整个检测流程SOP文件，对NGS技术检测全过程包括的样本收集处理、文库制备、测序、数据分析、结果报告等过程进行详细描述。生物信息学分析方面描述和记录数据处理和分析，包括变异识别，过滤和注释的所有过程。明确所有要使用的软件，包括来源（例如，内部开发的以及第三方的）以及任何修改。建议以列表形式描述所有需要的软件和/或数据库名称及其功能。申请人在计划开发一个有针对性的基因检测试剂时，需确定其预期用途和待测基因数量，包括将要检测的样本类型、适用人群以及哪些类型的检测信
8、息将被评估和报告。还应考虑影响检测的设计，验证和质量控制的其他因素。并在试剂组成说明书中应详细说明该产品包含的试剂组分及需要但未提供的试剂、设备及耗材。（二）主要原材料的研究资料NGS检测过程主要包括样本收集处理、文库制备、测序、数据分析、结果报告等。1.样本收集处理（如适用）样本收集处理过程是保证样本具有能如实反映患者体征的关键环节。申请人需提交涉及样本收集及处理相关试剂主要原材料信息，如样本的运输保存试剂、样本制备试剂、核酸提取试剂的主要组成成分等。2. 文库制备及测序测序文库及测序过程主要包含脱氧三磷酸核苷、接头序列、连接酶、聚合酶、逆转录酶、限制性内切酶、引物、探针、接头等；如为申请人
9、自行研究主要原材料，申请人应对测序文库构建的实验过程予以详述；并提供对各主要原材料的功能性研究。并对制备完成的原料成品进行质量检验以确认其符合标准要求，整个生产工艺应稳定可控。如为申请人外购主要原材料，应详述每一原材料外购方来源，提交外购方出具的每种原材料性能指标及质量控制资料，并详述申请人对外购主要原材料的各指标质量要求以及确定该原材料作为本产品主要原材料的详细依据。核酸类检测试剂的包装材料和耗材应无脱氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。3.生物信息分析及数据库要求NGS的数据分析流程或生物信息学流程一般可以分为四个主要操作：碱基识别，序列比对，变异识别和变异注释。明确
10、参考序列类型，辅助测序比对拼接和测序结果确认。不同突变类型可能需要开发不同的变异/突变检测算法。其次，因根据产品设计类型提供软件工具的范围和所需的验证类型。建议申请人提交数据库（参考序列）的溯源信息、数据库类型、完整性、实时性、维护以及升级方案以及分析软件的版本、算法、性能验证以及升级方案等资料。4.内部参考品是保证产品性能稳定性以及检测值可溯源的重要构成之一。参考品研究应包括原料选择、制备过程、定值研究、评价指标、统计学分析等。申请人应对内部阳性/阴性参考品的来源、基因序列设置等信息进行精确的实验验证，并提供参考品溯源过程的测量程序或参考方法的相关信息及详细的验证资料。具体要求如下：4.1阳
11、性参考品及阳性质控品：4.1.1阳性参考品理想状态下，阳性参考品应当包括对所申报产品每个基因型的质控样本。但考虑到基于NGS技术的可检测基因数量较多，申请人应结合产品预期用途、临床意义及基因类型等因素进行针对性和代表性的设计。阳性参考品应包含所有需有明确药物治疗用途的基因类型，如对药物使用具有明确指导性的位点的参考品设置，需至少包括不同基因类型中代表性的基因类型，应采用临床样本或细胞系提取的DNA储备液作为原料。对于具有显著临床意义或潜在临床意义的基因，因考虑代表性问题，明确具有临床诊断意义的基因类型及基因型中不同的变异类型，突变频率、变异类型的选取应具有代表性，包括不同外显子，不同基因变异突
12、变等。如检测目标区较大（大于1M），需对检测区域整体和灵敏度进行质控（特别是针对SNV），可以采用混合的永生化正常人白细胞DNA储存液（HapMap细胞系）等。不同突变/变异的变异丰度及突变频率，浓度范围设置应具有代表性并提供这样设定的依据。阳性参考品的突变形式及拷贝数需采用有效方法进行确认,并明确接受标准。申请人在设计阳性参考品时可一并考虑检测限参考品的设置及确认方式，并提供相关的依据。4.1.2阳性质控品模仿病人样本的目标核酸序列，并用于质控整个检测过程，包括核酸提取（如适用）、文库构建、测序和数据分析。目前阳性质控检测和分析过程应与临床样本方式一致。4.2阴性参考品及阴性质控品阴性参考品
13、应为FFPE 正常样本的混合物，阴性质控品FFPE 正常样本的混合物或细胞系，应明确不含有目标区域肿瘤突变基因以及目标基因中的胚系突变基因。 4.3精密度参考品精密度参考品设置要求可参考阳性/阴性参考品。4.4 PCR 试剂无模板参考品（NTC）申请人应建立NTC 对照Qubit 检测接受标准。监测检测过程中是否存在染污。 （三）主要生产工艺及反应体系的研究资料NGS检测是一个复杂的工作流程，它由很多独立步骤组合而成。基于NGS的检测可能包括但不限于以下步骤：样本采集，处理和存储;DNA提取;DNA处理和文库制备;序列读取和碱基识别;序列比对，变异识别，变异注释和过滤，变异评估和注释，以及生成
14、检测报告。一般而言，对于每个检测组成部分，申请人应建立其特定检测的指标和验收标准。必须对NGS每个操作流程的性能表现进行一个内部的验证。每步流程都需要分别优化到一个最佳经验值，以此来综合决定最佳的实验操作条件及各参数的设置。1.应能对反应体系涉及到的基本内容，如临床样本用量、试剂用量、反应条件、质控体系设置等，提供确切的依据，配制工作液的各种原材料及其配比应符合要求。2.主要生产工艺、反应原理介绍。逆转录过程（如涉及）及最佳反应体系的研究资料，包括酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离子浓度等。确定的温度和时间的研究资料。3.申报产品包含核酸分离/纯化试剂，应提交对核酸分离/纯化过程进行工
15、艺优化的研究资料。如包括但不限于核酸体积、质量、浓度、纯度及完整性等。核酸浓度、纯度检测方法包括但不限于荧光法等；核酸完整性检测方法包括但不限于琼脂糖凝胶法、实时荧光定量PCR法等。（四）分析性能评估资料分析性能评估是反映产品主要原材料选择，生产工艺及反应体系等多方面因素设置是否合理的客观评价指标。检测试剂性能的研究方案应结合产品的反应原理，临床预期用途，使用条件等综合因素进行设计。性能研究应涵盖产品研制阶段对试剂盒进行的所有性能验证的研究资料，包括具体研究方法、内控标准、实验数据、统计分析等详细资料。本部分内容将从NGS检验流程中的质量控制要求和主要性能指标两部分进行要求：1.NGS检验流程
16、检测方法中，应明确所有检测要素（例如，仪器，软件，消耗品，试剂）和用于检测的实验室设备的检测要素。确定设计方案和标准并详细记录设计研究过程。对于基于NGS的检测的每个组成，应该确定规范并记录。记录每个检测组成对于关键因素（例如覆盖率，碱基质量）的局限性。确定并记录基因组的检测区域，包括基因和变异类型，如果关键的测序区域不符合最低性能要求（例如最小覆盖标准），则应修改检测并重新验证以达到最低性能要求。同时，应在产品说明书和/或标签中明确可能影响或限制产品检测性能情形。1.1样本制备申请人需考虑可接受检测的样本类型对检测结果的影响，例如所需采集设备的类型，样本的最小体积或数量，或采集和使用之间样本稳定性必须遵守的任何采集条件。每种样本类型及采集方式应建立相应的SOP，并验证对其整体检测性能的影响。在NGS检测试剂的设计开发过程中，申请人应对配套使用的核酸提取、分离
