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1、2 质粒DNA的提取一、实验目的本实验通过质粒快速提取试剂盒的试剂对大肠杆菌中的重组质粒pET22b的抽提，掌握质粒DNA的小量制备方法，了解碱裂解法制备质粒DNA的原理。二、实验原理载体是基因工程所必需的工具，它用于将目的基因运载到宿主细胞内的克隆与表达。自然界的质粒经改造以后，常被用作基因工程技术的基因载体。常用的载体有质粒、噬菌体、M13噬菌体、逆转录病毒DNA和昆虫病毒DNA等，而质粒是最常用的载体。细菌质粒是存在于细菌染色体外，能够独立复制的环状DNA。质粒DNA小量制备是基因工程操作中的常规技术，提取的质粒DNA可用于酶切、连接与转化等。从大肠杆菌细胞中分离质粒DNA的方法众多，其
2、分离可依据并选择利用DNA分子大小不同，碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构等特点来进行。常用的有碱变性抽提法，羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法，两相法以及溴化乙锭-氯化铯密度梯度离心法。以上各种方法均有利弊，因此在制备质粒DNA时，要根据以下几个方面进行比较，选择最佳的实验方法：（1）质粒特性：如质粒宿主的菌属，是否需要用溶菌措施。质粒DNA的大小，分子量大的在制备过程中易受损伤，DNA易产生缺口；拷贝数、构型、复制型是否需要氯霉素扩增等。（2）提取质粒DNA的用量与用途：如用于初筛比较分子量大小、进行酶切、作探针或测序等。（3）提取方法的成本、程序、重复性、纯度以及实验
3、室具备的条件等。目前实验室中最常用、最有效的方法为碱变性抽提法和溴化乙锭-氯化铯密度梯度离心法两种。碱变性抽提法效果良好，既经济且收得率较高。提取到的质粒DNA可用于酶切、连接与转化。但该法如操作不慎，会影响纯度，且步骤复杂，费时较多。对于分子量较大拷贝较少的质粒DNA，由于DNA片段较大易于损伤断裂，因此选用氯化铯密度梯度超离心法抽提DNA，该法具有纯度高、步骤少、方法稳定且获得的质粒DNA是超螺旋构型等特点。对于高拷贝数质粒，用小量制备法抽提质粒DNA就有足够量可用于后续的操作。本试剂盒是由上海申能博采试剂公司提供的，其原理是采用碱裂解中和法。该法抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DN
4、A的变性与复性的差异而达到分离的目的。在pH高达12.6的条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但它的超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的醋酸钠高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，存在于溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀而被除去。再进一步利用酚，氯仿这两种蛋白质变性剂去除蛋白杂质，用无水乙醇沉淀质粒DNA，得到纯化的质粒DNA。采用碱裂解中和法，应用常规台式高速离心机，经反应条件最优化后，使含有质粒DN
5、A的上清通过设计独特的离心吸附柱式结构时，被特殊硅基质材料高效、专一地吸附。被吸附的质粒DNA随后可用洗脱缓冲液从离心吸附柱上洗脱下来， 本试剂盒有以下特点：（1）快速方便半小时完成一次实验，并能在一小时左右，同时处理10-20个质粒样本，操作简便。（2）高效优质省略苯酚、氯仿的抽提，减少了对质粒DNA的破坏。从2-3ml菌液可提取出约15-20g质粒DNA，其中超螺旋结构占90%以上，并且也无蛋白质、盐类、有机化合物的污染，可用作测序模板和其它酶促反应。三、仪器和试剂（一）仪器：高速离心机、螺旋混合器、冰盒、计时器、1.5mlEppendorf离心管。（二）试剂：已培养的菌液、质粒快速提取盒
6、（上海申能博彩试剂公司）、无水乙醇。四、实验步骤（一）准备工作：1.试剂公司将质粒快速提取盒送到实验室后，应立即将已加RnaseA的Solution 1置于4冰箱保存。2. Solution 2 及Solution 3如有白色沉淀、高盐结晶析出，请将瓶盖拧松后置于微波炉连续加热10-15秒，或37以下保温溶解，摇匀后使用。确保每使用完一种试剂后，立即盖紧该试剂瓶的瓶盖。3使用前，必须在22ml Wash Solution 瓶中加入50ml无水乙醇，充分混匀后使用，或按Wash Solution：无水乙醇为11：25的比例，用多少配多少。（二）实验步骤：1收集1.5-3ml菌液于1.5mlEpp
7、endorf离心管中，12000rpm离心1min，彻底弃去上清，管底保留沉淀菌体。如果菌体量太少，可再重复收集一次。2加入100l Solution 1，用移液器或振荡器彻底悬浮细菌。注意：（1）为了获得高质量的质粒DNA，培养细菌的时间不宜过长，一般为12个小时。如果是高拷贝质粒，1.5ml细菌将获得足够的DNA，对于低拷贝数的质粒，用5ml细菌；质粒如果用于全自动荧光测序，用5ml细菌，无须提高Solution 1，2，3的用量。（2）细菌沉淀中加入Solution 1后，一定要彻底悬浮，否则抽提质粒DNA的纯度及获得率会大大降低。3加入200l Solution 2，立即轻柔颠倒1.5
8、mlEppendorf离心管数次或用手指轻弹管底，使菌体充分裂解，裂解后的菌液变得清亮，置室温2分钟左右。注意：如果是同时抽提多个样品，加入一管，混匀一管，不要采用全部加入后再混匀的方法，计时从加入第一管时开始。4加入400l Solution 3，立即温和颠倒1.5mlEppendorf离心管5-10次，使之中和，室温放置2分钟。注意：步骤2和3在冰上操作，效果更佳。515000rpm离心10分钟，无需低温离心。注意：提高离心速度，使沉淀更加紧密，步骤6操作取上清更为方便。6取出2ml样品收集管和3S柱，在管壁标上样品号，将步骤5中的上清全部转移到（吸或倒入）3S柱子里，盖上离心管盖子（盖子
9、也可以不盖，但是如果你同时有很多样品，担心混淆或弄翻溶液，建议你盖上盖子），室温放置2分钟（室温放置时间不重要，可长可短）；用台式离心机室温12000rpm离心1分钟。注意：（1）转移上清时不要吸取沉淀物，否则会出现Genomic DNA和蛋白质污染。（2）离心管盖子盖上时，柱子内压的增加，可能会使溶液从柱子底部流出，为正常现象。7取下3S柱子，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同一支收集管中，吸取700l Wash Solution到3S柱，离心1分钟。8重复步骤7一次。9取下3S柱，弃去收集管中的废液，将3S柱放入同一支收集管中，高速离心2分钟。10将3S柱放入消毒的1.5mlEppend
10、orf离心管中，在3S柱子膜中央加50l TE或无菌双蒸水，不要盖上离心管盖，室温下放置2分钟；盖上离心管盖，室温高速离心1分钟。注意：将TE或无菌双蒸水预热50左右可以提高效率。测序质粒用30l预热的无菌双蒸水洗脱，浓度一般满足测序要求。11洗脱质粒可以立即用于各种分子生物学操作或 -20保存备用。1ml过夜细菌培养细胞，质粒如果用50l TE 或无菌双蒸水洗脱，通常情况下可以取10l洗脱液做 Agarose 电泳或酶切分析。12质粒Agarose 电泳： 0.8% 琼脂糖凝胶，10Tris-硼酸（TBE），10Lording Buffer0.5-1l，膜板（质粒）3l混匀。质粒Agaros
11、e 电泳参数：电泳仪的电压100V，电流500mA，功率250W。电泳时间为40分钟，一般过中线。（如图）质粒凝胶电泳图：一般结果为2条带，即：超螺旋的共价闭合状质粒（最亮的那条带），线状质粒（不太亮的那条带），有时还会出现一条带是开环质粒。五、注意事项1.各步骤的注意事项，已在各步的实验步骤中有所提及，请事先认真阅读。2.如果起始菌液体积较大， Solution 1， Solution 2， Solution 3的用量应相应扩大，但要确保比例关系为：Solution 1：Solution 2：Solution 3 = 2:3:3。3.对于大质粒(10kb)，在吸附柱中加入50l洗脱缓冲液后，55水浴5分钟，再离心1分钟。4.如果出现以下问题则可能的原因有：得率低:（1）如果RNA污染，可能：菌体过量；RNaseA失效。（2）如果基因组DNA污染，可能:洗脱液pH7.0；洗脱温度过低；洗脱液未加在吸附膜中央；步骤4将上清移入吸附柱时，吸入了絮状蛋白质。质量低:（1）如果是基因组DNA污染，可能:加入溶液Solution1后室温放置时间超过5分钟；加入Solution 2和Solution 3后混匀动作不温和；吸附柱上的样品离心不下去，样品中有较大量蛋白质。
