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1、现代环境测试技术实验讲义周家斌武汉理工大学资源与环境工程学院实验一 气相色谱质谱（ GC-MS ）法测定多环芳烃含量一、 实验目的：1了解 GC-MS 仪的基本构造，熟悉工作站软件的使用；2了解运用 GC-MS 仪分析样品的基本过程，掌握利用质谱标准图库检索和特征离子裂解原理进行色谱峰定性，以及内标法进行定量的分析方法。二、 实验原理：一台质谱仪的分析系统一般由四个部分组成： 进样系统 按电离方式的需要，将样品无分馏地送入离子源的适当部位。 离子源 是用来使样品分子或原子电离生成离子的装置， 除了使样品电离外， 离子源还必须使生成的离子会聚成有一定能量和几何形状的离子束后引出。 质量分析 器是
2、利用电磁场 (包括磁场、磁场与电场组合、高频电场、高频脉冲电场等 )的作用将来自离子源的离子束中不同质荷比的离子按空间位置、 时间先后或运动轨道稳定与否等形式分离的装置。 检测器是用来接收、检测和记录被分离后的离子信号的装置。 样品由进样装置导入离子源，在离子源中被电离成正离子或负离子 ,离子按质荷比大小由质量分析器分离后，被检测系统接收并记录而获的质谱图。质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。 本实验使用的质谱检测器采用电子电离源（EI），它的灯丝能发射出能量为 70ev 的电子束。从毛细管色谱柱流出的气体样品进入检测器后， 被
3、电子电离，生成的分子碎片经加速器加速后进入四极杆质量分析器进行分析。 质量是物质的固有特征之一， 不同的物质有不同的质量谱 质谱，利用这一性质， 可以进行定性分析； 谱峰强度也与它代表的化合物含量有关，利用这一点，可以进行定量分析。三、 仪器和试剂：Agilent 6890 5973N 型色谱质谱仪（美国安捷伦科技有限公司），配置HP-5MS 弹性石英毛细柱（ 30m 0.25mm0.25um）； 10 ul 微量注射器；针式1过滤器（有机相）。本实验分离分析的是 10 种多环芳烃混合物（菲、蒽、荧蒽、芘、苯并 a 蒽、屈、苯并 b 荧蒽、苯并 k 荧蒽、苯并 e 芘、苯并 a芘），溶剂为二氯
4、甲烷（色谱纯）。四、 实验步骤：1以二氯甲烷为溶剂，配制合适浓度的多环芳烃混合溶液；2使用 0.45 m的有机相微孔膜过滤器将混合溶液过滤至样品瓶中；3GC-MS 参数设定：色谱条件：载气为纯度 99.999%的氦气，进样室与传输线均恒温 300；程序升温： 65恒温 10min 后，以速率 10 /min 升至 300，恒温 20min；载气流速： N2，0.5ml min-1；进样量： 1l；不分流进样。质谱条件： EI 模式，电子能量70eV。离子化电流： 300a，倍增器电压：1100V。全扫描质量范围为35 500amu，扫描周期为 1.6s。4设置样品信息及数据文件保存路径后，按下
5、“ Start run键，”待 “ Pre-run ”结束，系统提示可以进样时，使用10l进样针准确吸取1l样品溶液（不能有气泡）。将进样针插入进样口底部，快速推出溶液并迅速按下色谱仪操作面板上的“ start按钮”，分析开始。5对得到的总离子流色谱图（ TIC），在不同保留时间处双击鼠标右键得相应的质谱图，在质谱库中检索后，根据匹配度、置信度可确定各峰的归属。根据质量色谱图、 特征碎片离子、 计算机联机的标准谱库检索， 来对化合物作定性分析，定量分析用内标法。五、实验结果与讨论：1显示并打印样品的总离子流色谱图(TIC) ，并学会应用选择离子色谱图（ SIM）和标准谱库检索，给出色谱峰定性结
6、果（含质谱检索结果、物质名称、保留时间）。2给出某一保留时间处菲、荧蒽和苯并a 芘的质谱图，分析它们主要产生了哪些离子峰。 根据质谱电离过程中分子碎裂的机理，写出这 3 种多环芳烃的分子碎裂过程。3运用化学工作站软件对10 种多环芳烃和内标物（芘-d10）进行峰面积积2分，以内标法定量每个多环芳烃化合物的含量。已知芘-d10 的浓度为 0.45mg/l。六、思考题1GC-MS 适用于分析哪些样品，请举例说明；并简述其主要优点。2与外标法相比，内标法定量有什么优势？用内标法可以克服哪些因素造成的误差？内标物的选择有什么具体要求？3实验二 高效液相色谱法（ HPLC ）测定正十六烷酸含量一、实验目
7、的：1理解高效液相色谱 (HPLC)的原理与应用；2掌握用保留值定性及用标准曲线法进行定量的方法。二、实验原理：高效液相色谱法 (HPLC) 是由经典液相色谱（柱层析、纸层析、薄层层析）发展起来的，采用高压液体作流动相并采用了新型固定相和连续自动检测系统，从而大大提高了理论塔板数， 具有快速、 高效等特点。 它克服了气相色谱法要求样品挥发性大、 热稳定性好的局限， 特别适用于大分子量的高分子化合物及离子型化合物的分离与分析。 HPLC 按分离原理可分为吸附色谱、键合相色谱、离子交换色谱和凝胶排组色谱。在以上四种分离方式中，反相键合相色谱应用最广，因为它采用醇 -水或腈 - 水系作流动相。 纯水
8、易得廉价， 它的紫外吸收极小。 在纯水中添加各种物质可改变流动相的选择性。 使用最广泛的反相键合相是十八烷基键合相， 即让十八烷基（ C18H37）键合到硅胶表面，这种键合相又称 ODS(Octadecylsily) 键合相。本次实验采用反相液相色谱柱进行分离， 以二极管阵列检测器进行检测， 以正十六烷酸 nC16：0 标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度做工作曲线， 再根据样品中的正十六烷酸的峰面积，由工作曲线算出其浓度。三、仪器与试剂：仪器： Agilent 1100 HPLC (美国 Agilent 公司 )， HP 工作站， ODS 柱， 5L定量环， 50ul 微量注射器。试剂： 1甲醇
9、（色谱纯），二次蒸馏水2正十六烷酸标准储备溶液四、实验步骤：1按操作指南开启仪器 , 使 Agilent 1100 HPLC 色谱仪正常工作，色谱条件为：4柱温： 25；流动相：甲醇：水 =80：20；流动相流量： 1.0ml/min；检测波长：210nm，进样量： 50 l 。2正十六烷酸标准系列溶液配制：将标准贮备液依次用纯水稀释，分别配制成浓度为 0.4、 0.8、2、4、8、20mg/L 的标准系列溶液。4绘制工作曲线：待液相色谱仪基线平直后，分别注入正十六烷酸标准系列溶液，并记下峰面积和保留时间。5样品测定：分别注入样品溶液，根据保留时间确定样品中正十六烷酸色谱峰的位置，记下正十六烷
10、酸色谱峰面积。6实验结束后，按要求关好仪器。五、 实验结果与讨论：1根据正十六烷酸标准溶液的色谱图，绘制正十六烷酸峰面积 A （mVs）与其浓度 (mg/L) 的标准曲线。2根据样品中正十六烷酸色谱峰的峰面积，由标准曲线计算样品中正十六烷酸含量。六、 思考题1用标准曲线法定量的优缺点是什么？2为什么改变流动相配比可以改变分离状况？附 :Agilent 1100高效液相色谱操作步骤：一、 开机1、开机前准备： 流动相使用前必须过 0.45um 的滤膜（有机相的流动相必须为色谱纯；水相必须用新鲜注射用水， 不能使用超过 3 天的注射用水， 以防止长菌或长藻类）； 把流动相放入溶剂瓶中。 A 瓶：为
11、水相 B 瓶：为有机相。2、打开电脑，选 Win 2000，进入 Win 2000 界面。3、双击 CAG Boodp server 图标，放大 CAG Boodp server 小图标，出现窗口，5min内打开液相各部件电源开关，等待1100 广播信息后，表示通讯成功连接，关闭5CAG Boodp serve 窗口。4、双击 online 图标，仪器自检，进入工作站。该页面主要由以下几部分组成：最上方为命令栏，依次为File，Run Control，Instrumen, 等；命令栏下方为快捷操作图标， 如多个样品连续进行分析、 单个样品进样分析、调用文件保存文件 , 等；中部为工作站各部件的
12、工作流程示意图；依次为进样器 -输液泵 -柱温箱 -检测器 -数据处理 -报告；中下部为动态监测信号；右下部为色谱工作参数：进样体积、流速、分析停止时间、流动相比例、柱温、检测波长等。5、从“ View”菜单中选择“ Method and control”画面。二、 编辑参数及方法1、开始编辑完整方法：从“ Method”菜单中选择“ New method”，出现 DEF-LC.M ，从“ Method” 菜单中选择“ Edit entire method”，选择方法信息、仪器参数及收集参数、数据分析参数和运行时间表等各项，单击 OK ，进入下一画面。2、方法信息：在“ Method Comm
13、ents”中加入方法的信息，如方法的用途等。单击 OK ，进入下一画面。3、泵参数设定：进入“ Setup pump”画面，在“Flow ” 处输入流量， 如 1ml/min ；在“ Solvent B”处输入有机相的比例如 70.0，（A=100-B ），也可在 Insert 一行“ Timetable”，编辑梯度；输入保留时间；在“ Pressure Limits Max”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。单击 OK ，进入下一画面。4、DAD 检测器参数设定：进入“ DAD signals ”画面，输入样品波长及其带宽、参比波长及其带宽（参比波长带宽默认值为100nm）； 选择 Stoptime： as
