蛋白质的提取及浓度测定

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1、浙江大学宁波理工学院生化分院实验报告专业：制药091学号：3090502111姓名：陈松泽实验 蛋白质的提取及浓度测定（紫外吸收法）一、目的与要求掌握蛋白质的提取方法；学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理；熟练掌握紫外分光光 度计的使用方法。二、实验原理大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙 酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质， 最大吸收峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度OD280与其浓度呈正比关 280nm系，可作

2、定量测定。三、实验材料、主要仪器和试剂1. 试验材料：萌发3天的小麦种子2. 主要仪器：（1）紫外分光光度计，（2）离心机（3）试管与试管架，（4）刻度吸量管 （5）研钵 （6） 100 mL容量瓶3. 试剂：标准牛血清蛋白溶液：准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清蛋白，配制成浓 度为1mg/ mL （0.5克标准牛血清蛋白纯水定容至500 mL）的溶液。四、操作步骤1. 蛋白质（淀粉酶）的提取称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加入少量石英砂和2 mL蒸馏水， 研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6 mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置 提取1520 min，每

3、隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3,000 r/min转速下离心10 min， 将上清液倒入100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为蛋白质原液，用于蛋白质浓 度的测定。2. 标准曲线制作按表1分别向每支试管内加入各种试剂，混匀。以光程为1 cm的石英比色杯，在280 nm波长处测定各管溶液的光密度值OD简。以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出标准280nm曲线。管号标准蛋白质溶液（mL）蒸馏水（mL）蛋白质浓度（mg/mL）OD280nm104020.53.50.12531.03.00.2541.52.50.37552.02.00.5062.51.50.62573.0

4、1.00.7584.001.0表1蛋白质标准曲线制作3. 样品测定取提取的蛋白质溶液，按上述方法测定280 nm的光密度，并从标准工作曲线上查出提取蛋 白质溶液的浓度。若提取蛋白质溶液的浓度大于2.0,超出测量范围，则稀释后再测，计算蛋白质 浓对于不含核酸污染的蛋白溶液（如果样品光吸收值大于2.0,应将样品稀释至光吸收值小于 2.0）：选择蛋白缓冲液作为空白对照，测定280 nm波长处的光吸收值，一般来说，1 A280 Unit -lmg/ml （对于浓度位于0.02 mg/ml3 mg/ml范围之内的蛋白样品而言如此，对于浓度小于0.1 mg/ml的蛋白样品，可以采用以下的方法估算：蛋白浓度

5、匕A205/31）对于存在核酸污染的蛋白溶液：选择蛋白缓冲液作为空白对照，测定280 nm和260 nm波长 处的光吸收值，或280 nm和205 nm波长处光吸收值，按照以下公式计算：蛋白浓度（mg/ml）= 1.55 x A280 - 0.76 x A260蛋白浓度（mg/ml） = A205 - （27 +A280/A205）度时乘以稀释倍数。五、思考题1. 为何要在280 nm波长下测定蛋白质浓度？在其它波长下测定可以吗？蛋白质分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯环结构，在紫外280nm波长处有最大吸 收峰，其光吸收值与蛋白质浓度成正比，故用280nm波长吸收值大小来测定蛋白质含量

6、。优点： 快速； .对蛋白质无破坏性。缺点： .不是严格的定量方法。因为此法是根据酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp） 残基的强吸收值来测定的，不同的蛋白质具有不同的消光系数。另外，当蛋白质分子中不含Tyr、 Phe或Trp残基时，该方法就不能检出蛋白。（此法用于测粗提总蛋白浓度较为适宜） .核酸可引起强烈干扰。灵敏度：0.2 mg/ml 2 mg/ml；比色杯最小测量体积为0.1 ml。注意事项：实验室通常认为用1cm的比色杯所测光吸收值为1.0时，蛋白浓度约为1mg/ml,这是非常 不精确的。如果实验所用的缓冲液和水有较高的光吸收值，说明缓冲液中有干扰物质存在。2. 如果考虑核酸的存在，蛋白质浓度的实际的值比测量值是大还是小？为什么？蛋白质浓度的实际的值要比测量值偏大。因为核酸里含有N （氮元素），而测量蛋白质浓度时 主要就是测N （氮元素）的含量，所以核酸的存在会导致N （氮元素）含量的增加，最终导致蛋 白质浓度的测量值偏大。