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1、.wd牙髓干细胞1牙髓干细胞概念牙髓组织位于牙齿内部的牙髓腔内，是牙体组织中唯一的软组织。2000年Gronthos1等通过对人牙髓细胞的研究，发现了一种与骨髓间充质干细胞有着极其相似的免疫表型及形成矿化结节能力的细胞，细胞中形态呈梭形，可自我更新和多向分化，有着较强的克隆能力。这些由牙髓组织中别离出的成纤维状细胞就称为牙髓干细胞(Dental Pulp Stem Cells,DPSCs)。现在普遍认为牙髓组织中具有形成细胞克隆能力和较强增殖能力的未分化间充质细胞即DPSCs2。2牙源性干细胞至今，已从人类牙齿相关组织中别离和鉴定出7种干细胞:(1)牙髓干细胞(dental pulp stem
2、 cell,DPSC)1，来自恒牙牙髓；张巍巍等3以人牙髓干细胞为种子细胞与PLGA支架材料在体外进展复合培养，说明PLGA有利于于牙髓干细胞的粘附与增值。Lindroos等4得到DPSC与其他间充质源性干细胞具有相似的外表标志物和骨相关性的标志物的结论，支持DPSC在硬组织再生方面的可能性。从成人第三磨牙牙髓中别离的DPSC在适宜的条件下可诱导分化为有功能活性的神经细胞，并在基因和蛋白水平表达神经组织专有的标志物5，为治疗神经系统方面的疾病提供了新的途径。DPSCs不表达成牙本质细胞特征性蛋白DSP、DMP，那么说明DP-SCs尚处于未分化状态6。我国学者通过对根髓和冠髓进展对比时发现：DP
3、SCs 存在于全部牙髓之中,在根髓中的密度更高7。(2)人类脱落乳牙牙髓干细胞(stem cell from the pulp of human exfoliated deciduous teeth, SHED),来自儿童脱落乳牙的牙髓;Miura等8研究发现，正常脱落的乳牙牙髓中的细胞经培养会表现出成纤维细胞样生长，其增殖率和群体倍增数均比骨髓基质干细胞(BMMSC)、DPSCs高，于是首次提出了SHED的概念。Shen YY等9发现SHED在体外培养过程中可以表达成骨细胞的标志，如RUNX-2、OCN、BSP，说明SHED在体外可以分化为成骨细胞;将SHED与人类牙齿切片复合后，在体外培养
4、或是植入免疫缺陷小鼠皮下，均表达成牙本质细胞分化的标志( DSPP，DMP-1，MEPE)10。一系列实验说明SHED在体内只能诱导宿主细胞分化为成骨细胞11，而其自身无法分化为成骨细胞，但在体外培养过程中却可以分化为成骨细胞。SHED 可能还具有参与机体的免疫调节等功能12。李丽文13等用不同密度接种培养 DPSCs,计算细胞产量、倍增次数, 观察细胞形态、检查克隆形成率和钙结节形成能力的方法得到，1.53cells/cm2低密度接种培养 DPSCs 有利于细胞快速扩增,扩增后的细胞保持较高的增殖和分化潜能。SHED的增殖能力、克隆形成效率和钙结节形成能力均优于DPSCs。(3)根尖乳头干细
5、胞(stem cell from the apical papilla,SCAP)14,15，来自牙根发育未完成的根尖乳头；Abe等16从人年轻第三磨牙根末端别离根尖周牙乳头，并采用酶消化法从中别离出细胞进展研究，结果发现这种细胞在低密度下培养时，能够像其他间充质干细胞一样形成贴壁生长的克隆原细胞聚集，并具有成骨、成牙本质和成脂等多向分化潜能，因而作者将这种细胞命名为SCAP。SCAP是牙根发育时成牙本质细胞的重要来源，在牙根的形成和发育中起着重要的作用，具有强于DPSCs的群体倍增能力以及增殖率、端粒酶活性和细胞迁移率，是一种极具潜力的成体干细胞17。张富强等18以第l代猪牙乳头细胞作为干细
6、胞与-磷酸三钙支架复合后将其接种于裸鼠皮下，结果成功地构建出牙髓牙本质复合体样构造。Ikeda等19发现，人牙乳头间充质细胞经过培养、增殖和处理可分化为成骨组织，说明人牙乳头间充质细胞可用于骨组织再生。Shi等20还发现根尖牙乳头间充质细胞的牙再生能力强于DPSC，原因是牙乳头中所含的干细胞数量高于成熟的牙髓。(4)牙周膜干细胞(periodontal ligment stem cell,PDLSC)或牙周膜祖细胞(periodontal ligment progenitor cell,PDLPC)21，均来自牙周膜; Byoung-Moo等22用酶消化法将安康成年人的牙周膜组织制成单细胞悬液
7、进展体外培养，通过克隆筛选和磁珠别离得到了具有形成细胞克隆能力和高度增殖能力的细胞，从而提出了牙周膜干细胞(PDLSCs)的概念。正常情况下，牙周膜细胞可通过增殖和分化使其本身以及与之相连的牙骨质和牙槽骨处于不断更新和改建的状态。而当受到疾病或外界刺激时，那么可通过牙周膜中干细胞的不断增殖和分化使组织再生23。关于PDLSCs的细胞表型，免疫组化结果显示PDLSC 表达间充质干细胞的标志物，而这些标记物是鉴定PDLSC的根基24。PDLSC和PDLP那么偏重牙周组织的重建。在临床上主要是利用干细胞的分化和再生潜力促进组织愈合和再生25,26。(5)人类智齿牙滤泡祖细胞(precusor cel
8、l from human dental follicle of wisdom teeth,PC)，或称为牙囊干细胞(dental follicle stemcell,DFSC)27,来自智齿牙囊；牙囊(dental follicle，DF)是包绕发育牙齿的疏松结缔组织。Honda等28从小牛牙根形成阶段的恒切牙牙胚中别离出牛DF细胞，进展了一系列试验，证明DF细胞中含有牙周膜细胞及牙骨质细胞的前体细胞；目前研究发现在口腔的不同组织中均别离出干细胞。(6)牙槽骨干细胞(alveolar bone proper derived stem cell,ABPSC)29,来自牙槽骨骨髓。(7)牙龈/口腔
9、黏膜干细胞(ginginval/oral mucosa stem cell,OMSC)30,31，来自牙龈黏膜下结缔组织或来自牙胚的间充质干细胞(mesenchymal stem cell from tooth germ)32，其来源属于牙髓干细胞；另外还有根尖牙囊干细胞(periapical follicle stem cell, PAFSC)33，属于上述的SCAP。牙源性干细胞具有间充质干细胞的功能特性和多向分化能力，并表达间充质干细胞的外表标志物如CD44、CD73、CD105，但不表达CD34和CD4534。不同来源的牙源干细胞如图1所示。OMSC:牙龈/口腔黏膜干细胞;ABPSC:
10、牙槽骨干细胞;DPSC:牙髓干细胞;SHED:人类脱落乳牙牙髓干细胞;DFSC:牙囊干细胞;SCAP:根尖乳头干细胞;PDLSC:牙周膜干细胞。图1 不同牙源干细胞的来源组织部位3牙髓干细胞的别离培养3.1仪器和材料仪器：超净工作台。倒置相差显微镜及照相系统，流式细胞分析仪，细胞筛网，JEM-2000EX透射电镜。平底24孔、96孔塑料培养板。二氧化碳恒温培养箱，细胞培养瓶及培养板，高速离心机，细胞记数板，可见光分光光度计，酶联免疫检测仪。材料：现在国内实验中采用的普遍的牙髓细胞来源于临床上因阻生而完整拔除的下颌第三磨牙(获得患者许可)，要求牙齿安康，无牙体牙周疾病，患者年龄1225岁35。人
11、源乳牙：610岁安康儿童无牙体牙髓疾病的滞留乳牙；鼠源性牙髓细胞：5周龄大鼠，雄性。5周龄裸鼠，雌性；犬源性牙髓细胞：56个月龄的比格犬的安康年轻恒牙；46月龄小型猪乳下切牙等牙齿。3.2细胞别离培养培养牙髓干细胞方法有酶联合消化法、组织块培养法和组织块酶消化法。别离牙髓干细胞方法有三维悬滴法和免疫磁珠分选法。3.2.1酶联合消化法以2000年，按Gronthos等1的酶联合消化方法,将人乳牙牙髓组织在完全培养液浸润下剪碎，3 g/Lcollagenase type I、4 g/L dispase按11比例混合，于37 水浴中消化乳牙牙髓组织1 h，离心弃上清液，沉淀用培养液充分混匀，反复吹打
12、离散细胞团块，经70m的细胞筛网过滤获得单细胞悬浮液，参加含体积分数15%胎牛血清的DMEM培养液，置入3.5cm培养皿内37恒温培养箱标准条件下培养。别利克孜卡德尔36等人在2013年对酶联合消化法进展了改进。将人乳牙牙髓组织标本块浸入同样的消化液中，仅在37水浴中消化15 min左右，待组织块呈絮状参加完全生长液终止消化，300g离心力离心5 min，弃去上清液，将组织团块均匀铺入3.5 cm的培养皿中，在各组织块处分别滴加50-100 L完全生长液，置入37、体积分数5%CO2培养箱中孵育，两三天更换完全生长液，待组织周边有较多的细胞爬出后，挑弃组织块，补足完全生长液继续孵育。当大多数克
13、隆的细胞集合至80%-90%时，吸弃培养液，进展传代扩增培养。3.2.2组织块培养法新鲜采集的牙髓，在生物安全柜中用PBS洗3遍，置于6 cm培养皿中，参加少量完全DMEM/F12培养基其中含20%FBS、1% L-Glutamine、1% NEAA及1%双抗浸润牙髓组织，用无菌手术剪将其剪碎，盖玻片将组织块固定在培养皿中，37、5CO2培养。48 h换液，此后每3、4d更换1次培养基。培养约1014d会有细胞从组织块中爬出，细胞到达8090集合后，用TrypLE在37 消化，按1:3比例传代37。3.2.3组织块酶消化法(1)牙拔除后用75%酒精擦拭牙体外表消毒，再用含青霉素、链霉素的 PB
14、S 浸洗牙2次备用；(2)原代细胞培养：无菌条件下劈开牙齿，取出牙髓，切除根尖部约2 mm 牙髓组织，剪成大小约1mm1mm1mm的组织块，用4%型胶原酶消化45min，终止消化，1000r/min离心5 min，弃上清，所得组织用含20%胎牛血清的-MEM培养液重悬后接种于35 mm培养皿，于37、5%CO2恒温孵箱内培养，待细胞长至80%集合率时，胰酶消化传代(3)有限稀释法克隆纯化人牙髓干细胞：取对数生长期的原代细胞，调整细胞密度，把细胞稀释到10个/mL，以100l /孔接种于96孔培养板内，培养24 h后镜检，挑出单个细胞的孔，继续培养；待单克隆面积至孔底50%以上时，取多个克隆培养
15、细胞混合扩大培养38。3.2.4三维培养法参考并改进Gronthos1的方法，从安康人体的第三前磨牙中获取牙髓，用酶消化法和酶解组织块法进展原代DPSCs培养并常规传代。人DPSCs的三维培养法：将处理好的0.25g Cytodex3微载体与50ml含1105/ml第四代DPSCs的新鲜DMEM/F12(含15%FBS)混合均匀，载入经高压灭菌的HARV中，此时，培养基充满整个容器，无气泡，调整转速，使微载体不与器壁碰撞，不在中心聚集。整个装置放入37，5%CO2的培养箱中。常规换液39。3.2.5免疫磁珠分选法原代细胞收集方法：按照Gronthos1的方法，在体外进展原代培养，获得细胞放入3
16、7，5%CO2培养箱中培养3 d后弃去未贴壁细胞，PBS清洗每3d换液一次。细胞生长达80%融合时1：3传代。取生长状态良好的第3代乳牙牙髓细胞1108，以含1%胎牛血清的PBS重悬，参加STRO-1抗体，4孵育60min，每隔10min轻振，防止细胞沉淀。然后用含1%的胎牛血清的PBS清洗3次，去除残留抗体；细胞再次重悬通过30m的滤网获得单细胞悬液，按说明参加相应剂量的磁珠混匀，4孵育15min，参加10ml缓冲液以300g离心力离心10min，完全去除上清;加500l缓冲液混匀细胞团；将分选柱置磁力架上，用500l缓冲液预先润湿分选柱，缓冲液快要滴完时将细胞悬液参加到分选柱内不要产生气泡，待细胞
