《细菌的各种计数法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细菌的各种计数法（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1、计数器测定法： 即用血细胞计数器进行计数。取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。由于计数室的容积是一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。本法简便易行，可立即得出结果。 本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。2、电子计数器计数法: 电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。 该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。3、活细胞计数法 常用的有平板菌落计
2、数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数。此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。使用该法应注意：一般选取菌落数在30300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O0012，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；本法限用于形成菌落的微生物。 广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。 4、比浊法 比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓
3、度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。 此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。 5、测定细胞重量法 此法分为湿重法和干重法。湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。 此法适于菌体浓度较高的样品，是测定丝状真菌生长量的一种常用方法。6、测定细胞总氮量或总碳量 氮、碳是细胞的主要成分，含量较稳定，测定氮、碳的含量可以推知细胞的质量。此法适于细胞浓度较高的样品。 7、颜色改变
4、单位法（colourchangeunit,简称CCU） 这种方法通常用于很小，用一般的比浊法无法计数的微生物，比如支原体等，因为支原体的液体培养物是完全透明的，呈现为清亮透明红色，因此无法用比浊法来计数，由于支原体固体培养很困难，用cfu法也不容易计数，因此需要用特殊的计数方法，即CCU法。它是以微生物在培养基中的代谢活力为指标，来计数微生物的相对含量的，下面以解脲脲原体为例，简单介绍其操作： （1）.取12只无菌试管，每一管装1.8ml解脲脲原体培养基。 （2）.在第一管加入0.2ml待测解脲脲原体菌液，充分混匀，从中吸取0.2ml加入第二管，依次类推，10倍梯度稀释，一直到最末一管 （3）
5、.于37度培养，以培养基颜色改变的最末一管作为待测菌液的CCU，也就是支原体的最大代谢活力，比如第六管出现颜色改变，他的相对浓度就是10的6次方CCU/ml. 一般来说，比浊法和菌落计数法就可以满足绝大多数细菌的计数，但是对支原体这样比较特殊的微生物，用CCU法比较合适。 测定微生物生长的方法很多，各种方法均有其优缺点，也不是在任何情况下都适用。在微生物学工作中一般常用的是平皿菌落计数法、计数器法和比浊法。至于哪种方法比较适合你，得根据你的具体条件而定。 采用滤膜法进行微生物检测是一种国际公认的微生物标准检验方法，其得到AOAC、美国、欧洲和日本等国家的药典、FDA和EPA等组织的承认，广泛应
6、用于环境监测、食品及饮料工业、化妆品、制药工业品质控制和电子工业等领域。 而在我国每一新版药典中无菌检查法（微生物限度检查）在都有不同程度的改进和提高，特别是2000年版药典较95版药典有了较大提高，大幅度增加了样品的取样量，提高了阳性检出率。2005年版药典更加完善，既增加了样品的取样量，又延长了培养时间，降低了漏检率，提高了安全性，和各国药典接近，与国际接轨，提高了我国的药典标准。 2005版中国药典规定只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。赛多利斯公司的滤膜法微生物检测产品成功地应用于滤膜法已有20多年的历史，实用而且方便实用，它简化了微生物检测程序。 滤膜法微生物检测： 将适当孔径的滤
7、膜放入滤器，过滤样品，由于滤膜的作用而将微生物保留在膜的表面上。样品中微生物生长抑制剂可在过滤后用无菌水冲洗滤器而除去。然后，将滤膜放在培养基上培养，营养物和代谢物通过滤膜的微孔进行交换，在滤膜表面上培养出的菌落可以计数，并和样品量相关。 滤膜法的优点： -与直接法比较，可以检测大量的样品 -浓缩效应使微生物检测的准确度提高 -带有菌落的滤膜，可作为检测的永久记录存档 -可见的菌落和样品量直接对应，得出定量结果细菌计数 counting of bacteria 指测计酵母、细菌等的细胞数。有总菌计数和活菌计数两种计数法。后者是测计试样中的活细菌数。二者都是先把试样稀释成适于测计的浓度，再用种种
8、方法进行细胞数的测计。一般认为用细胞计数器测计更为精确。有的方法是把细胞用血球容量计进行离心沉淀，从其刻度的容积进行换算；还有一种方法是比浊法。在测计固氮细菌时，可用凯氏定氮法测定有机氮（或是蛋白态氮），然后换算成细菌数。进行活菌计数时，先把样品稀释，然后将一定量稀释样品混入依菌性质制成的溶融状态的琼脂培养基中进行平面培养，再根据菌落数进行统计。对已鉴别过的菌种或具有某种特定性质的细菌来说，活菌计数比较简单，但对土壤微生物区系量的分析就比较复杂了。在微生物学研究中,经常需要测定培养溶液中细菌数量,比色法和比浊法是常用的方法,细菌培养液中含有活的和死的细菌、未利用完的培养基以及细菌生长过程中的代
9、谢产物等,因此,培养液的吸光度值并不完全是细菌(活细菌、死细菌)数量的真实体现。作者比较了2 种方法(细菌培养原液、培养液离心后沉淀+ 无菌水) 测定培养液中细菌数的差异和对细菌生长曲线测定结果的影响,以期为液体培养条件下细菌数的快速测定提供参考。1 材料与方法1. 1 试验用菌株 由患烂爪病的中华鳖血液中分离所得,并经检验为气单胞菌属嗜水产气单胞菌种。1. 2 细菌培养 选用不同pH 值的营养肉汤培养基。在预先标号的试管中分别加入不同pH 值(pH 值设定为4. 5 、5. 0 、5. 5 、6. 0 、6. 5 、7. 0 、7. 5 、8. 0 、8. 5 、9. 0 、9. 5 、10
10、. 0 、10. 5 、11. 0 共13 组) 的培养基5mL ,121. 5 灭菌30 min ,然后在每支试管中加入经24 h 复壮培养的均匀菌悬液100L ,30 、140 r/ min 振荡培养24 h ,待测; 连续培养,定期采样。使用500 mL 锥形瓶,普通肉汤培养基,培养方法同,培养过程中间隔1 h 连续采样。1. 3 细菌浓度与吸光值的相关性计算 活细菌数测定采用稀释平板法,细菌总数测定采用血球计数板在显微镜下直接计数。对细菌悬液吸光值的测定采取3 种方法进行: 以原培养基作对照,在420 nm 处直接测定细菌悬液吸光值(记ODa) ; 将培养后的细菌悬液离心(3 000r
11、/ min、30 min) ,取沉淀加入与上清液等量的无菌生理盐水,混匀后,以无菌盐水作对照,测定溶液吸光值(记ODb) ; 以原培养基作对照,测定离心后上清液的吸光值(记ODc) 。参照Lambert2Beer 定律logI0/ I = kC(其中logI0/ I 为吸光度、C为细菌浓度) ,计算活菌数和细菌总数与对应溶液吸光值的关系,并求出常数k 。2 结果与分析2. 1 不同pH值条件下细菌悬液的吸光值 测定不同pH 条件下的细菌培养悬液吸光度与离心沉淀+ 无菌盐水的吸光度值是两条不同的曲线,离心上清液的吸光值也不是1 条与横坐标重叠或平行的直线。说明在培养基中除细菌影响吸光值大小外,不
12、同培养条件下的培养基质对吸光值的影响也不尽相同。2. 2 连续培养过程中细菌悬液吸光值的变化 细菌在连续培养21 h 过程中,间隔1 h 连续测得细菌培养原液、培养液离心上清液及培养液沉淀+ 等量无菌水在420 nm 处的吸光值。2 种菌悬液(培养液,离心沉淀+ 无菌盐水) 的吸光值变化趋势一致,但在数量上存在一定差异。在细菌培养过程中不断有培养液组份消耗和细菌代谢产物增加,同时死亡细菌的消融产物也会对离心上清液的吸光值产生影响。因此,显示出上清液随时间延长吸光值不断增加。试验中也发现,上清液颜色随培养时间延长变化明显,由棕黄色逐步变为浅黄色。2. 3 细菌浓度与吸光值的关系连续培养细菌5 h
13、 后,在420 nm 处测定2 种菌悬液(培养原液,培养液离心后经无菌盐水定容) 的吸光值分别为0. 519 和0. 368 。经1/ 10 梯度稀释后采用平板法计数,培养液中活细菌数为5. 082 1023个/ mL ,根据Lambert2Beer 定律,2 种方法测得的活细菌数与吸光度的关系分别为logI0/ I = 1. 021 10 - 24 C , logI0/ I = 7. 241 10 - 25C。显微计数培养液中细菌总数为5. 2851024 ,是其中活菌数的10. 4 倍,证明在细菌培养液中存在大量已经死亡的细菌。3 讨 论 在比浊法测定细菌浓度时,有的方法采用未接种的液体培
14、养基作为空白对照1 ,3 ,但是,在细菌的生长过程中培养基质与原培养基并不完全一致。本实验结果证实:不同细菌浓度培养物经离心沉淀后,上清液的吸光度并不完全相等,即使使用原培养基作为空白对照,也不能完全消除不同培养时期或不同培养条件下培养基对吸光度的影响。死细菌对液体环境中细菌浓度的测定也有一定影响,试验对原培养液进行稀释培养和显微计数的结果差异明显,说明培养液离心沉淀物中存在大量死的细菌。活的和死的细菌之间的比例与培养条件、细菌接种量及培养时间等密切相关,如何消除这些影响,作者认为在研究细菌生长特性时应区分活细菌和细菌总数与吸光度的关系。希望我的回答可以为你提供一些帮助O(_)O我个人认为，在实验并不需要浓度有多么精确的前提下，可以利用分光光度法测定活菌浓度。
