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1、西南政法大学司法鉴定中心作业指导书文件编号FSC07TDM-2页号第1页共9页版次第一版第1次修改标题STR 与性别位点基因型检测审核人王旭东批准人易旻发布日期2008年11月18日1目的 通过对D3S1358等STR位点的基因型检测，进行亲子鉴定和个体识别。2适用范围 本作业指导书适用于法医物证学实验室对刑事、民事以及非诉讼案件中人体血液（斑）、羊水、带毛囊毛发、混合斑、精斑、组织等生物学检材的DNA基因型检验以及性别位点的检测。3职责 中心主任批准具有法医物证鉴定资格的鉴定人履行此项工作。4试剂 本法所用试剂为分析纯，在有效期内使用；使用pH试纸测定溶液的pH值。 4.1 10mg/ml蛋
2、白酶K：lmg蛋白酶K溶于100l双蒸水中，每管30l分装，冰箱冻存。 4.2 lmol/L DTT：称取0. 77g DTT，加入5ml双蒸水，溶解后加入50l lmol/l NaAc(pH 5.2)，混匀。 4.3 Chelex 100 (50-100 mesh)：5g Chelex 100加双蒸水至50ml，检查pH为9-11。 4.4 0. 5mol/L EDTA：于800ml双蒸水中加入186. 1g Na2EDTA - 2H2O，在磁力搅拌器上搅拌溶解（可加20g NaOH助溶，此时pH=8.0士0.2)。检查pH，用水定容至1L。 4.5 Powerplex 16 System扩
3、增试剂盒（Promega公司）：冰箱冻存。4.6 GeneScan-600 ILS ( Promega公司）：2-6保存。 4.7 POP-4(ABI公司）：2-6保存。 5设备仪器 5.1 310 型遗传分析仪。 5.2 9700型PCR扩增仪。 5.3 振荡器。 5.4 台式高速离心机。 5.5 恒温干燥箱。 5.6 计算机。6原理 从生物学检材中抽提DNA，针对D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E，D5S818, Dl3S317, D7S820, Dl6S539, CSFIPO, Penta D，vWA, D8Sl l79, TPOX, FGA等S
4、TR位点和性别位点Amelogenin进行复合PCR扩增，将扩增产物进行电泳分析，确立基因型。7程序 7.1 DNA提取 7.1.1从血样中提取DNA： (1) 在1.5ml离心管中加1ml双蒸水，然后加入3l全血（约9mm2血斑），小心混匀；西南政法大学司法鉴定中心作业指导书文件编号FSC07TDM-2页号第2页共9页版次第一版第1次修改标题STR 与性别位点基因型检测审核人王旭东批准人易旻发布日期2008年11月18日 室温保温30min，间歇振荡； (2) 10000-15000 r/min离心2-3min；小心移去上清液。若样品为血斑，则保留载体； (3) 沉淀中加入10% Chele
5、x 100 (50-100mesh) 200l; 56保温30min； (4) 高速振荡5-10sec; 100 8min； (5) 高速振荡5-10sec; 10000-15000 r/min离心2-3min，取上清液用于PCR扩增；2-8保存或冻存剩余DNA。 7.1.2从毛发中提取DNA： (1) 用三蒸水清洗毛发；剪取毛根部分；放入1.5ml Eppendorf管中； (2) 加入200l 10% Chelex 100(50-100 mesh）及2l 10mg/ml PK（蛋白酶K) , 56 保温6-8hr或过夜； (3) 高速振荡5-10sec；沸水煮8min(注意毛发应浸没于Ch
6、elex液）； (4) 高速振荡5-10sec；10000-15000 r/min离心2-3min；取上清液用于扩增反应，2-8保存或冻存剩余DNA。 7.1.3从口腔刮拭物样本中提取DNA: (1) 用牙签刮拭口腔粘膜，将其放入1. 5ml离心管内，加入200l 10% Chelex (50-100 mesh)；搅动，使细胞脱落； (2) 56保温15-30min； (3) 高速振荡5-10sec；100 8min； (4) 高速振荡5-10sec, 10000-15000 r/min离心2-3min； (5) 取上清液用于扩增反应；2-8保存或冻存剩余DNA。 7.1.4从唾液斑中提取DN
7、A： (1) 取9mm2唾液斑放入1.5ml离心管中，加1ml三蒸水于室温浸泡30min； (2) 用牙签搅动使载体细胞脱离载体，去除载体；10000-15000 r/min离心lmin; (3) 去上清仅留50l，用无菌吸头吹打沉淀；加10 % Chelex 100 (50-100 mesh）至200l, 56保温15-30min; (4) 高速振荡5-10sec；100 8min; (5) 高速振荡5-10sec, 10000-15000 r/min离心2-3min；取上清液用于扩增反应；2-8保存或冻存剩余DNA. 7.1.5从精液中提取DNA: (1) 取3l精液放入1. 5ml离心管
8、内，加入200l 10% Chelex 100(50-100 mesh) ; (2) 加入2l 10mg/ml蛋白酶K和7l lmol/L DTT，轻轻混匀； (3) 56保温30-60min，高速振荡5-10sec; (4) 10000-15000 r/min离心10-20sec; (5) 100 8min; (6) 高速振荡5-10sec; 西南政法大学司法鉴定中心作业指导书文件编号FSC07TDM-2页号第3页共9页版次第一版第1次修改标题STR 与性别位点基因型检测审核人王旭东批准人易旻发布日期2008年11月18日 (7) 10000-15000 r/min离心3min; (8) 取
9、上清液用于扩增反应； (9) 2-8保存或冻存剩余DNA，再次使用时重复步骤6-8. 7.1.6从精斑样品中提取DNA: (1) 取适量精斑检材，剪碎后放到1. 5ml离心管中； (2) 加入1ml三蒸水，室温保温30min; (3) 高速振荡lmin，用牙签去除载体； (4) 10000-15000 r/min离心2min; (5) 去上清仅留50l，用无菌吸头吹打沉淀； (6) 取3l悬液经染色后镜检； 注：如果检出上皮细胞，则按混合斑DNA提取法操作； (7) 加入10 % Chelex100 (50-100 mesh）至200l，加入2l 10mg/ml蛋白酶K和7l lmol/L D
10、TT，轻轻混匀； (8) 56保温60min; (9) 高速振荡5-10sec, 10000-15000 r/min离心10-20sec;(10) 100 8min; (11) 高速振荡5-10sec, 10000-15000 r/min离心3min; (12) 取上清液用于扩增反应； (13) 2-8保存或冻存剩余DNA，再次使用时重复步骤11-12。 7.1.7从混合斑样本中提取DNA: (1) 取适量检材，剪碎后放入1.5ml离心管中，加1ml三蒸水； (2) 室温浸泡30min; (3) 用牙签搅动2 min，使载体细胞脱离载体，去除载体（注意：待基液中镜检到精子后再弃去载体）； (4
11、) 10000-15000 r/min离心lmin; (5) 去上清仅留50l，用无菌吸头吹打沉淀； (6) 取3l悬液放于载玻片上，经染色后镜检； (7) 如果无上皮细胞检出，则直接从步骤13开始操作； (8) 加灭菌水150l，再加2l10mg/ml蛋白酶K，轻轻混匀； (9) 保温1-2hr以消化阴道上皮细胞（注：不得超过2hr，否则精子细胞也会被消化）； (10) 10000-15000 r/min离心5min; (11) 取150l上清液与50l 40 % Chelex 100(50-100 mesh)混合，以备女性DNA分析检验，见步骤14; (12) 悬浮沉淀于0.5ml精子洗涤
12、液（10 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA,50mmol/L NaCl, 2 % SDS, pH 7.5)，振荡片刻，10000-15000 r/min离心5min，去上清仅留西南政法大学司法鉴定中心作业指导书文件编号FSC07TDM-2页号第4页共9页版次第一版第1次修改标题STR 与性别位点基因型检测审核人王旭东批准人易旻发布日期2008年11月18日50l，重复2次； (13) 悬浮沉淀于1ml三蒸水，振荡片刻，10000-15000 r/min离心5min，去上清仅留50l，用无菌吸头吹打沉淀，取3l镜检； (14) 加150l 10% Chelex 10
13、0(50-100 mesh), 2l10mg/ml蛋白酶K及7l lmol/L DTT，轻轻混匀； (15) 56保温60min; (16) 剧烈振荡女性阴道上皮细胞及精子细胞样品5-10sec，100 8min; (17) 高速振荡5-10sec, 10000-15000 r/min离心3min，取上清液用于扩增反应； (18) 2-8保存或冻存剩余DNA，再次使用时重复步骤16。 7.1.8从含精子的口腔拭子中提取DNA: (1) 用棉签刮拭口腔粘膜，取适量拭物放入1.5ml离心管中，加入1ml无菌双蒸水； (2)室温保温30min; (3) 用牙签搅动2min使细胞脱落，去除牙签和纤维；
14、 (4) 10000-15000 r/min离心2min; (5) 去上清仅留50l，吹打，取3l镜检。如果检出精子头，则按混合斑DNA提取法从步骤7开始操作。 本实验室常规采用Chelex法抽提DNA，对于质和量不确定的检验材料（如精斑、混合斑、石蜡包埋块等），在抽提DNA后，通过对DNA溶液进行系列稀释（如2倍、10倍、100倍），然后采用DNA扩增试剂进行扩增分析（操作按说明书进行），通过电泳条带荧光强度的观察确定适宜的DNA模板浓度，再正式按以下步骤进行检测。 7.2检测 7.2.1 PCR扩增 常规使用商品化的Powerplex 16 System试剂盒，进行15个STR位点及1个性别位点的基因型检验。若使用其他扩增检测体系，则必须先进行可行性测试，确认其合格。需要增加其他STR位点的检测时，可使
