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1、 METAFECTENE PRO中文说明书 适用于哺乳动物细胞运输：室温运输（收到后冷冻保存）保存：小于-15度保质期：推荐使用期日之前（见标签）使用：只用于体外实验，不适用于人或动物的诊断、治疗、临床研究。产品描述：METAFECTENE PRO是最新一代的哺乳动物细胞转染试剂的新标准。它融合了biontex公司的RMA（斥膜酸解）技术和TOP(毒性最优)技术，这些技术能调控脂质体在细胞内释放遗传物质，使得一方面，细胞毒性影响是最小的，另一方面，最大限度提高了DNA质粒在胞奖中的浓度和被核摄取的几率。之前很多文献得出结论是METAFECTENE 在转染效率上和 METAFECTENE 相差不
2、大，但是针对比较难转和非常难转的细胞，METAFECTENE PRO表现更优越的特性。1.基本信息1.1 规格适用类型 转核酸物质进入哺乳动物成分 阳离子脂质体和胶质溶于水是否无菌 检测无菌是否用于细胞培养 验证过使用寿命 1年保存条件 -15度冷冻1.2质量控制标准的转染试剂包装，没有细菌和真菌污染，已经采用硫基乙酸盐培养基证实过。1.3有效期标签 METAFECTENE PRO提供的是ready-to-use的即用液，它没有血清抑制特性，因此它是转染敏感细胞的最佳选择。 保存 METAFECTENE PRO 常温运输，收到之后立即存放于-15度下冷冻保存。冷冻状态能最小减低脂质体老化过程。
3、短暂几天在室温状态对它影响不大，但切忌避免反复冻融。 细胞状态 用于转染的细胞必须是处于生长对数期，细胞在对数生产期之前（细胞密度大约30%-60%）有一段静止期，这个期间不太适合做转染，因此，推荐用传代细胞来做转染实验。微生物的污染如支原体、真菌能破坏转染的结果，biontex提供MYcoSPY和MYcoRAZOR用于快速检测和去除支原体的污染。 细胞密度 真实的细胞密度做转染不能简单通过显微镜下观察来评估，而需要做光学检测做标准曲线和对比细胞计数。一个好的转染结果获得必须建立在细胞密度大概为90%-100%，通常相对于转DNA而言，转染siRNA是不依赖于细胞分裂的，因此需要细胞密度会小一
4、些。优化尽管METAFECTENE PRO可以适用于很多细胞类型又有很好的转染特性，但是如果我们适当优化转染条件例如质粒、细胞株等比例，可能会得到更接近于我们想要的结果。每种细胞有自己的最优DNA/RNA/siRNA-lipo 的比例，培养的器皿、脂质体复合物的形成和细胞状态都能影响到最终吸收的转染试剂的量。此外，用于别的转染试剂的实验方法不能照搬用于METAFECTENE PRO，任何转染试剂都有其自己独特的分子结构和独特的物理特征，不能笼统用一种方案来做。适当优化的说明在第3部分给出。当然，在这些因素中，只有微小的优化是必须的如果您的实验都考虑这些因此的干扰的话。DNA/RNA/siRNA
5、最好使用高纯度级别的。因为内毒素能削弱转染效率，举例来说，在这之前DNA/RNA/siRNA被用于脂质体复合物METAFECTENE PRO，那么DNA/RNA/siRNA保存在稀释的培养基中不能超过5min。容器材料表面的小孔能吸收DNA/RNA/siRNA导致转染效率大幅降低。聚丙烯材料显示是最低吸附转染试剂和遗传物质的。稳定转染如果你想得到很漂亮的转染结果，请按照下面操作指南来接种较低密度细胞。在开始转染那天起，细胞密度应不少于50%，完成转染操作步骤后，用适当的含有抗生素培养基取代转染用的培养基。2.操作指南2.1 转染贴壁细胞标准操作方法-12孔板 （我们推荐起点按我们的提到的起点，
6、优化按P10条件优化）1.在12孔板中，接种1.0-4.0*105（起点为2.0*105）每个小孔接种细胞1ml，悬于新鲜的完全培养基中。2.孵育细胞于37度CO2培养箱中，直到细胞达到为90%-100%的融合，这个时间会有差异，一般来说需要花18-24h3.将保存的DNA/RNA/siRNA和转染试剂取出，保持到室温。做到快冻慢升温。4.准备接下来的溶液稀释，用96孔细胞培养板或者其他的低吸附的小管，推荐使用聚丙烯塑料材料。必须先用枪头加入培养基，高纯度的液体不能直接接触塑料表面。 溶液A 0.5-1.5ug DNA/RNA 溶于 50ul 无血清和无抗生素培养基或者PBS溶液 溶液B 1.
7、0-7.0ul METAFECTENE PRO溶于 50ul无血清和无抗生素培养基或者PBS溶液 温馨提示：DNA/RNA:脂质体比例=1：1 ug DNA/RNA:ul METAFECTENE PRO=1:7 比率需要优化的其他影响因素见第3和4部分 增加液体A的体积，相应增加液体B体积，不可以将比例搞反。5.尽可能的轻柔缓慢用枪头吹打一次将溶液混合。6.将溶液A和溶液B混合，尽可能的轻柔缓慢，用枪头吹打一次将溶液混合。室温孵育15-20min。温馨提示：剪切压力会破坏DNA/RNA-lipo复合物就如DNA双联一样。7.孵育完之后，将AB混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀，置于37度
8、CO2培养箱。8.根据细胞类型不同，增强活性不同、细胞提取基因的活性不同，24-72小时后启动转染。2.2转染悬浮细胞-标准方法1.在12孔板中，接种1.0-4.0*105（起点为2.0*105）每个小孔接种细胞1ml，悬于新鲜的完全培养基中。2.将保存的DNA/RNA/siRNA和转染试剂取出，保持到室温。做到快冻慢升温。3.准备接下来的溶液稀释，用96孔细胞培养板或者其他的低吸附的小管，推荐使用聚丙烯塑料材料。必须先用枪头加入培养基，避免高纯度的液体直接接触塑料表面。 溶液A 0.5-1.5ug DNA/RNA 溶于 50ul 无血清和无抗生素培养基或者PBS溶液 溶液B 1.0-7.0u
9、l METAFECTENE PRO溶于 50ul无血清和无抗生素培养基或者PBS溶液 温馨提示：DNA/RNA:脂质体比例=1：1 ug DNA/RNA:ul METAFECTENE PRO=1:7 比率需要优化的其他影响因素见第3和4部分 增加液体A的体积，相应增加液体B体积，不可以将比例搞反。4.尽可能的轻柔缓慢用枪头吹洗一次将溶液混合。5.将溶液A和溶液B混合，尽可能的轻柔缓慢，用枪头吹洗一次将溶液混合。室温孵育15-20min。温馨提示：剪切压力会破坏DNA/RNA-lipo复合物就如DNA双链一样。6.孵育完之后，7.孵育完之后，将AB混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀，置于3
10、7度CO2培养箱。7.根据细胞类型不同，增强活性不同、细胞提取基因的活性不同，24-72小时后启动转染。2.3 转siRNA最初优化方案-以24孔板为例1.在24孔中按每孔接种0.1-1.0*105细胞，悬于0.5ml新鲜完全培养基中。对于大多数类型细胞，达到30%-50%的融合，可以开始转染实验。2.将保存的DNA/RNA/siRNA和转染试剂取出，保持到室温。做到快冻慢升温。3.准备接下来的溶液稀释，用96孔细胞培养板或者其他的低吸附的小管，推荐使用聚丙烯塑料材料。必须先用枪头加入培养基，避免高纯度的液体直接接触塑料表面。 SiRNA-lipo与METAFECTENE PRO混合比例Tub
11、eR1R2R3R4siRNA0.1ug(Ca.7.5pmol)0.2ug(Ca.15pmol)0.5ug(Ca.40pmol)2.0ug(Ca.150pmol)加无血清培养基或者PBS30ul30ul30ul30ulTubeM1M2M3M4METAFECTENE PRO0.5ul1ul2.5ul10ul加无血清培养基或者PBS40ul40ul40ul40ul 温馨提示：增加siRNA的体积，相应增加METAFECTENCE PRO的体积，不可将比例搞反。4. 尽可能的轻柔缓慢用枪头吹洗一次将溶液混合。5. 混合溶液R1+M1,R2+M2,R3+M3,R4+M4，尽可能的轻柔缓慢，用枪头吹洗一次
12、将溶液混合。室温孵育15-20min。6.孵育完之后，这时siRNA-lipo复合物逐滴进入细胞，小心将培养板摆动混匀，置于37度CO2培养箱。温馨提示：剪切压力会破坏DNA/RNA-lipo复合物就如DNA双链一样。7.根据细胞类型不同，siRNA稳定性不同、mRNA稳定性不同和目的蛋白不同、研究基因knock-down不同，一般在24-72h开始转染，一旦siRNA-lipo复合物加入细胞，没必要清洗去除，直接换液即可。温馨提示：要想获得高效率的和低非特异性影响，优化转染条件通过改变siRNA和lipid的浓度来实现。2.4共转染实验（siRNA-DNA）METAFECTENE PRO在共
13、转染短暂抑制RNA和质粒DNA效果也很不错。通常而言，质粒转染需要高的细胞密度，对比与siRNA转染而言，因此我们推荐：1.细胞接种密度和时期按照转染DNA的方法2.按照siRNA转染一样的比例，对应调节脂质体总量-核酸总量的比例，如果你想增加总的核酸量，对应成比例增加METAFECTENE PRO的量。3.通常使用的METAFECTENE PRO的体积（ul）至少是最终核酸质量（ug）的2倍以上。3.优化指引3.1关键的优化参数METAFECTENE PRO和DNA/RNA/siRNA比率最重要的优化参数是METAFECTENE PRO和DNA/RNA/siRNA的比率，一种成功的转染试剂是
14、带少量正电荷的DNA/RNA/siRNA-METAFECTENEPRO复合物，DNA/RNA/siRNA-METAFECTENE PRO比率依赖于细胞系。高质量的转染复合物为了获得高质量的转染结果，优化吸收的DNA/RNA/siRNA-lipo-complex是必须的。优化DNA/RNA/siRNA-METAFECTENEPRO比率和DNA/RNA/siRNA-lipo-complex的浓度可能会随之改变细胞数量。过多的复合物能导致超表达或者细胞溶解（脂质体本身是溶解试剂）因此必须保持接种细胞数量和孵育期的稳定直到转染过程可以再度优化这些参数。接种细胞数量见5.2部分血清的影响然而，几乎所有的细胞系用METAFECTENE PRO来转都表现漂亮的结果即使是培养基中含有血清的情况下，但是特殊的细胞可能显示不同的特性。因此，转
