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1、苏丹红 ELISA 快速检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用 产品编号 ： CSB-E12032f 检测范围： 1.56 ng/ml-100 ng/ml 最低检测限 ： 0.39 ng/ml 特异性： 本试剂盒可用于快速检测苏丹红。与对位红有一定交叉反应。有效期 ：6 个月 预期应用： ELISA 法定量测定鸡蛋，辣椒粉，辣椒酱等样品中的苏丹红残留。说明1. 试剂盒保存：-20C (较长时间不用时)；2-8C(频繁使用时)。 2浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。3. 中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。4. 刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此
2、为正常现象，不会对实验结果造 成任何影响。概述苏丹红，又名“苏丹” 。苏丹红并非食品添加剂，而是一种化学染色剂。它的化学成份 中含有一种叫萘的化合物， 该物质具有偶氮结构， 由于这种化学结构的性质决定了它具有致 癌性，对人体的肝肾器官具有明显的毒性作用。1995年欧盟(EU)等国家已禁止其作为色素在食品中进行添加， 对此我国也明文禁止。 但由于其染色鲜艳， 印度等一些国家在加工辣椒 粉的过程中还容许添加苏丹红I。实验原理 本试剂盒采用免疫竞争法检测苏丹红。 微孔板上包被有抗苏丹红抗体。 加入苏丹红酶结合物和苏丹红标准品或样品，游离苏丹红与苏丹红结合物竞争微量反应板上的抗苏丹红抗 体，没有结合的
3、酶结合物被洗去。 再向反应孔中加入相应反应底物 TMB ，作用一定时间后， 结合的酶结合物将 TMB 转化为蓝色，转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的苏丹红呈 负相关。用酶标仪在 450nm波长下测定吸光度(0D值)，计算样品浓度。试剂盒组成及试剂配制1. 已包被兔抗三聚氰胺抗体的酶联板(Assay plate )：一块( 96 孔)。2. 标准品(Standard ): 2 xiOOul/瓶。3. 样品稀释液(Sample Diluent): 1 20ml/瓶。4. 辣根过氧化物酶标记苏丹红结合物( HRP -Sudan) : 1 XOOul/瓶(1 : 100)。5. 辣根过氧化物酶标记
4、苏丹红结合物稀释液( HRP -Sudan Diluent): 1 x 10ml/瓶。6. 底物溶液(TMB Substrate ) : 1 XOml/瓶。7. 浓洗涤液(Wash Buffer ): 1 X20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。8. 终止液(Stop Solution) : 1 X10ml/瓶(2N H2SO4)。需要而未提供的试剂和器材1. 标准规格酶标仪2. 高速离心机3. 电热恒温培养箱4. 超声清洗器5. 离子交换小柱( PCX )6. 氮气吹干仪7. 干净的试管和 Eppendof 管8. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器9. 蒸
5、馏水，容量瓶等 标本的稀释原则： 首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量， 确定适当的稀释倍数。 只有稀释至标准 曲线的范围内， 检测的结果才是准确的。 稀释的过程中， 应做好详细的记录。最后计算浓度 时，稀释了 “ N倍，标本的浓度应再乘以“ N。标准品的稀释原则：2瓶，每瓶浓度为100 ng/ml，以样品稀释液做系列倍比稀释，分别稀释 100 ng/ml， 50 ng/ml， 25 ng/ml ， 12.5 ng/ml ， 6.25 ng/ml ， 3.12 ng/ml ， 1.56 ng/ml 。样品稀 释液直接作为标准浓度 0 ng/ml 。辣根过氧化物酶标记苏丹红结合物的稀释原
6、则： 临用前以辣根过氧化物酶标记 苏丹红结合物 稀释液稀释， 稀释前根据预先计算好的每次实验 所需的总量配制（每孔50ul），实际配制时应多配制 。如10ul辣根过氧化物酶标记 苏丹红结合物 加 990ul 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 的比例配制， 轻轻混匀， 在使用前 一小时内配制。操作步骤实验开始前， 请提前配置好所有试剂， 试剂或样品稀释时， 均需混匀， 混匀时尽量避免起泡。 每次检测都应该做标准曲线。 如样品浓度过高时， 用样品稀释液进行稀释， 以使样品符合试 剂盒的检测范围。1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品或待测样品10
7、0ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，然后在所 有孔中加入 50 ul 辣根过氧化物酶标记苏丹红结合物工作液 。尽量不触及孔壁，轻轻晃 动混匀。酶标板加上盖或覆膜，37C反应30分钟-1小时。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。2. 温育后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干。3. 依序每孔加底物溶液 90ul, 37C避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前 3-4 孔有明显的梯度蓝色，后 3-4 孔梯度不明显，即可终止） 。4. 依序每孔加终止溶液 50ul，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液
8、的加入顺序相同。 为了保证实验结果的准确性， 底物反应时间到后应尽快加入 终止液。5. 用酶联仪在 450nm 波长依序测量各孔的光密度（ OD 值）。 在加终止液后 15分钟以内 进行检测。注：1. 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。2. 每次实验留一孔作为空白调零孔， 该孔不加任何试剂， 只是最后加底物溶液及 2N H 2SO4。测量时先用此孔调 OD 值至零。3. 为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。4. 未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8 C保存。标准品、辣根过氧化物酶标记苏丹红结合物工作液请依据所需的量配置使
9、用。请勿重复使用已稀释过的标准品、辣根过氧化物酶标记苏丹红结合物 工作液。5. 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。 洗板方法手工洗板方法： 吸去（不可触及板壁） 或甩掉酶标板内的液体； 在实验台上铺垫几层吸水纸， 酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少 0.3ml 注入孔内，浸泡 1-2分钟。根据需 要，重复此过程数次。 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。计算以标准物的浓度为横坐标（对数坐标） ，OD 值为纵坐标（普通坐标） ，在半对数坐标纸上绘 出标准曲线， 根据样品的 OD 值由标准曲线查出相应的浓度； 再乘以稀释倍数； 或用标准物 的
10、浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式， 将样品的 OD 值代入方程式， 计算出样 品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。注意事项1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。2. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。3. 一次加样时间最好控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。5. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。6. 在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。7. 底物请避光保存。8. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。9. 本产品适用于大量样本的快速筛查。由于生物试验存在人为及不可预知的影响因素，本 试剂盒得到的检测结果仅为参考， 不能据此做出任何结论。 本公司不承担由此引起的任何责 任。
