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1、南方医科乂修生物化学实验报告姓 名: 学 号: 专业年级: 组 别:生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称肝糖原的提取、鉴定与定量实验日期实验地点合作者指导老师评分XX教师签名李某某批改日期2013-06-03格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times NewRoman； 标题用： 四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出 现多行、多页空白现象。一、实验目的1、掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。2、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项， 掌握其操作方法。3、正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。4、熟练运用溶
2、液混匀的各种方法。5、正确掌握溶液转移的操作。6、正确操作使用分光光度计。二、实验原理1、肝糖原的提取与鉴定糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋 白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使 用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用 95乙醇将 滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中， 依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。CuSO4 十 2NaOH = Na2
3、SO4+Cu(OH)2；2Cu(OH)2 十 C6H12O6 = 2CuOH 十氧化型葡萄糖+H2O2CuOH = Cu2OJ(红色)+H20Cu(OH)2= CuOJ(黑色)+H202、肝糖原定量测定糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物 5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在 620nm 处有最大吸收。糖含量在(10100)g范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。 利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法(直接比较法) 即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先
4、臵于浓碱中加热，以破坏其它成分，而保留肝糖原。三、材料与方法： 以流程图示意1、材料：(1)样品：鸡肝(2) 试剂：95%乙醇、5% (W/V)三氯乙酸、浓盐酸、12.5mol/L (50%) NaOH溶液、 碘试剂、班氏试剂、5.35mol/L (30%) KOH溶液、标准葡萄糖液(50mg/L)、蔥酮显 色剂(3) 仪器和器材：普通离心机、室温-100C恒温水浴箱、可见光分光光度计、托盘天 平、剪刀、镊子、研钵、试管架、离心管、试管、100mm*15mm试管、刻度吸量管(2ml、 5ml)、1000 口 l微量可调取液器、100ml容量瓶、白瓷反应板2、方法：1) 肝糖原的提取与鉴定2）肝
5、糖原定量测定四结果与讨论：结果：实验数据、现象、图谱；讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。1、结果：（1）实验现象：1）肝糖原的提取与鉴定第一次离心后，肝匀浆分为 2层，上层为上清液，不完全澄清，下层为淡褐色沉淀。图1肝匀浆图2肝匀浆第一次离心后 加入乙醇混匀并静置后，溶液分层，上层为上清液，下层有白色絮状沉淀。 第二次离心后，溶液分为2层，上层为上清液，试管底部有少量白色沉淀。图3第二次离心后的白色沉淀 加入蒸馏水并沸水浴后，白色沉淀溶解。 白瓷板上，糖原溶液加碘试剂后呈红棕色，与碘自身的黄色有明显区别。图4呈色对比结果（左为糖原溶液加碘试剂，右为碘试剂） 往糖原水解液中加入班氏试剂后
6、，溶液呈蓝色（班氏试剂本身为蓝色）。沸水浴后,溶液变为砖红色（生成砖红色沉淀）。图5糖原水解液图6沸水浴前2）肝糖原定量测定往鸡肝中加入KOH并沸水浴后，溶液变为红棕色。图7沸水浴后图8沸水浴后，溶液变为红棕色水浴前，空白管呈黄色，标准管呈绿色，样品管呈黄色（颜色比空白管浅）。水浴后,空白管无明显变化，标准管颜色略变深，样品管由黄色变为深绿色（颜色比标准管深）。图9水浴前图10水浴后（2）实验数据：测定次数标准管样品管10.5930.40120.5930.39730.5940.396平均值0.5930.398表1标准管和样品管测得的吸光度（a620）及平均值按下式计算样品中肝糖原的含量：A10
7、0100样口肝糖原（g/100g 肝组织）=* 0.05 * * 1.11A肝组织重（g）1000标准由于样品稀释了一倍，因此计算结果需乘二。结果：肝糖原的含量为4.966g/100g肝组织。故本次实验结论为：该鸡肝样品含有肝组织，且肝糖原含量为4.966g/100g肝组织。2、讨论：（1）实验数据分析：本次实验测得肝糖原含量为4.966g/100g肝组织。查书得饱食鸡肝肝糖原含量为23g/100g肝组织。本次实验结果偏大，说明肝组织中含有过多肝糖原， 试验所用鸡肝为脂肪肝。2）呈色对比结果分析：糖原溶液与碘试剂反应呈红棕色，与碘试剂本身的黄色区别明显，说明糖原含量较大。（3）糖原水解液与班氏
8、试剂反应结果分析：该反应主要是通过检测葡萄糖与班氏试剂 的还原性糖反应间接鉴定溶液中糖原的存在。糖原溶液被浓盐酸水解为葡萄糖，葡萄糖中的醛基可被Cu（0H）2氧化为羧基，即把葡萄糖氧化为葡萄糖酸，Cu2+则被还原生成Cu2O 砖红色沉淀。因此水浴后，溶液由蓝色变为砖红色，实验现象明显。（4）注意事项：1）蒽酮试剂为浓硫酸所配制，使用时应小心谨慎。若不慎沾到皮肤上，应立即用大量清水冲洗。2）离心后，用移液枪吸取上清液时应避免枪头触及沉淀，否则会使沉淀物上浮，导致 上清液浑浊。避免将枪头伸到液面下再按按钮，否则枪头喷出的气泡也会激起沉淀物。3）打开室温-100C恒温水浴箱盖子时要小心水蒸气，以免烫伤。4）使用离心机时要注意配平，否则会损坏离心机。5）使用分光光度计时不得在仪器界面上转移试剂，以免腐蚀分光光度计。6）肝糖原提取中，往上清液加入 95%乙醇时要充分混匀。溶液总量较大，混匀操作不易，可用倾倒混匀或用玻璃棒搅拌混匀。7）肝组织必须在沸水浴中全部溶解，否则影响比色。8）蒽酮试剂必须 2 倍于被测液。
