酵母菌分离筛选方法要点

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1、酵母菌的分离筛选方法酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条 件下，液体培养比霉菌快。菌落与细菌相似，较大而厚，多数不透明， 菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色， 圆形 椭圆 卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。含高糖浓度（45%），分离蜂蜜酵母，球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。1. 培养基：1.1 葡萄糖 50g/L 尿素 1g/L （ NH4）2SO41g/L KH2PO42.5g/LNa HPO 0.5g/L MgSO 1g/L FeSO 0.1g/L 酵母膏 0.5g/L 孟加2 4 4 4拉红 0.03g/L PH4.5-5.0 （富集用

2、）1.2 乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯 200g/L 葡萄糖（霉菌用蔗糖）20g/L乳酸5ml马铃薯去皮切片200g，加水煮沸30min,纱 布过滤，补足蒸馏水1L, PH自然。（去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培 养用）（富集用）1.3麦芽汁培养基：1: 4水60-65C水浴3-4小时，4-6层纱布过 滤，可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤， 10-15 波林，氯霉素 0.1g/LPH6.0-6.4121 C20min（分离保存用） 灭菌后加入 300u/ml 硫酸链霉素（集菌用） 1.4虎红（孟加拉红）培养基：蛋白胨5.0g/L葡萄糖10g/LKH PO1.0g/L

3、 MgSO 0.5g/L 孟加拉红 0.033g/L 氯霉素 0.1g/L 琼244脂 15g/LPH自然分离纯化用）1.5豆芽汁培养基：黄豆芽100g/L葡萄糖50g/L PH自然。100g黄豆芽，加水煮沸30min,纱布过滤，补足蒸馏水1L1.6察氏培养基：主要培养霉菌观察形态用蔗糖30g/L硝酸钠3g/L磷酸氢二钾lg/L氯化钾0.5g/L硫酸镁0.5g/L 硫酸亚铁 0.01g/L 琼脂 15-20g/L 121C 20min PH 自然一般分离黄酒酵母 酒精酵母使用曲汁培养基，啤酒酵母用酒花麦汁培养基，葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。2. 集菌：研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系

4、，一般不 进行集菌，以免改变其中不同种类数量间的对比，将样品制成菌悬液 按常规法分离。若从样品中分离特定种类时先集菌。集菌发酵力强菌 株，加酸性含糖的培养基，酸性豆汁，必要时注入高浓度的酒精（13-17%）,霉菌在液体中形成菌丝体，酵母不形成菌丝，25-28C2-3d，遇到菌丝体用接种环挑去烧掉，去掉上清液，取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中，集菌连续两至三次才能完成，要配合镜 检。实例：将待分离的样品10g （ml）放入90ml无菌水或生理盐水/150ml 三角瓶（玻璃珠），摇床振荡20-30min，取上清液接种于酸性培养液（乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基酸性麦芽汁或酸性豆芽汁）25-282

5、-3d，培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉，集菌连续两至三次，培养 液变成混浊，产生菌膜和沉淀物。镜检：美兰染液染色，活菌可还原 美兰染液，菌体无色。3.筛选：分离：取集菌液适当稀释，吸取0l-02ml梯度菌液（至少两个两个平衡），涂布于马铃薯-葡萄糖 麦芽汁或虎红培养基平板，也可采用 混菌法或蘸取集菌菌液直接划线，（平放12h后倒置培养），25C培养 48h,低温酵母菌15C高温酵母菌35C 40C 45C，形成清晰菌落。在培养皿底划分小方格，待菌落生长良好后，用放大镜或低倍镜，观 察每格内每个菌落编号并描述，颜色 表面 边缘 切面等，再制片在 高倍镜下观察各菌株的个体形态，做好记录。选择不同菌

6、落分别接于 麦芽汁斜面，25C培养48小时备用。纯化：培养基与分离培养基相同，否则，不同培养基菌落会改变形态， 决不能认为菌落外观相同菌属于同一种。菌落外观相近的菌落，只能 挑取一至数个菌落为代表进行纯化。常用方法为平板划线分离法：挑 取单菌落于平板划线纯化菌株，25-28C 2-3d，选择菌生长快菌落 大 典型继续纯化，每个分离物至少经两次划线，结合镜检保持菌株 的纯度，对于保存菌株也应定期检查纯度。纯化的菌株转接于麦芽汁 斜面25-28C 2d待鉴定或用灭菌液体石蜡封面于4C冰箱保存。筛选：性能测定：根据不同需要，选择不同性能测定方法。产气性能比较：采用杜氏管发酵法，将斜面菌种两环接种于麦

7、芽汁或 豆芽汁液体培养基中（可以分两次加培养基），28C振荡培养48h, 产气时间和产气量。产酒精能力测定：采用蒸馏法测酒精含量产香能力测定：通过嗅觉鉴定。附：不同酵母菌的形态特征： 酿酒酵母：在麦芽汁琼脂培养基上，菌落与细菌相似，比细菌大而厚， 不透明，表面光滑，湿润粘稠，乳白色，形成假菌丝。单细胞，形状 有圆形 椭圆形等，大小不一。在麦芽汁中，沉淀表面形成环状膜。不能利用硝酸盐。产朊假丝酵母：在麦芽汁琼脂培养基上菌落为乳白色，平滑，有光泽 或无光泽，边缘整齐呈菌丝状。细胞呈圆形 椭圆形和圆柱形等。能 利用硝酸盐为氮源。实例1：大曲中酵母菌的分离及鉴定1. 富集培养：取 5g 样品，在试管中

8、加入 10ml 麦芽汁培养基，同时加 入一滴乳酸摇匀，25-28C24h,后取1ml菌液转入另10ml麦芽汁培 养基试管中培养25-28U 24h，稍长（过长则霉菌长出）培养液变浊 产膜或沉淀。观察：用无菌操作法取少许菌液置于载玻片中央的 0.l% 美蓝染色液中，混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜 观察酵母菌的形态和出芽生殖情况。活酵母菌可使美蓝还原，从而使 菌体不着色，用此方法可判断酵母菌的死活。要求：较高的糖50g/l，抑菌剂孟加拉红0.03 g/L （许多细菌放 线菌和快速生长的霉菌），PH45。或用乳酸（5ml）-马铃薯（200g）-葡萄糖（20g）培养基富集。2. 酵母菌

9、分离：平板划线 涂布或混菌均可。取集菌菌液，梯度稀释， 取10-5 10-6 10-7,0.1ml菌液涂布虎红培养基上，25-28C 48h （若 不纯可挑取单菌落连续多次划线）。3. 酵母菌选择：对典型单菌落，经美兰染色，制片镜检，进行描述性记录，然后选择不同菌落转接于麦芽汁斜面，25-28 48h备用。4. 酵母菌纯化：挑取 10-7 培养基不同的单菌落，在 PDA 培养基接种25-28C 2-3d后，取形态不同的单菌落传接二次，观察菌落形态确定为单菌落后，分别接种于 PDA 培养基和 MA 培养基中， 25-28 3d，根据在不同培养基中菌落形态进行初步分类。将所得菌株于斜面培养 保存在

10、 4冰箱中。实例2：高温堆积糟醅中酵母菌的选育1.集菌同上45C 2-3d，依此法转接2-3次，再行分离。2. 分离：梯度菌液分别涂布于麦芽汁 麸皮汁 豆芽汁平板于 452-3d，将平皿上生长的菌落划线纯化，菌株移入斜面，备用。3. 有效菌株的确认：分离的数十株酵母经镜检有酵母属的各种酵母， 假丝酵母，红酵母，白地霉等。用高粱粉糖化液，饴糖稀释液，麸皮 等进行发酵，测定次生代谢产物，依次判出Y1 Y2 Y3 Y4等与酱香酒 产量质量有关。4. 菌种的分类鉴定：4.1 形态特征：（麦芽汁琼脂）编号形态特征Y1 菌落由白色到奶油色，无光泽，软而平滑或部分有皱纹。边缘呈波纹，凸起， 色黄，中心凹，奶

11、油色，室温放一月后，培养物由奶油色变浅褐色。细胞呈圆 卵 圆 椭圆，大小不等。单个，成双，偶尔成短链，多边芽殖。 （意大利酵母）Y2 菌落呈浅奶油色，菌落平滑或部分有皱纹，无光泽，边缘呈黄色，大波纹状。 细胞圆形卵形 椭圆形，大小不等，多边芽殖。（地生酵母）Y328C 3d 后，细胞圆形 椭圆形，单个或成双，两端芽殖，培养物奶油状，奶 油色到浅褐色，平滑，稍平坦，光亮，边缘偶尔波纹，无真菌丝。 （酿酒酵母）Y4 菌落白色至奶油色，无光泽，软而平滑或部分有皱纹。培养时间偏长菌落渐 硬，并呈菌丝状，不易挑起。在麦芽汁平皿上，菌落白色，凸起，有皱纹，边缘 波纹状。细胞较小，卵圆 椭圆形，有大量真菌丝

12、。 （间型假丝酵母） 4.2 生理生化特征4.2.1 发酵糖类：酵母菌发酵液成分分析Y1Y2Y3Y4香气稍酱香，酯香 稍酱香，酯香酯香醇甜香酒精（%）3.93.94.35.1代谢产物乙丙 丁乳 异戊酸同 Y1除硫甲基丙醇乙丙 丁乳酸乙醛 乙酯 乳酯 丙醇其他成分均有乙醛丙醇异丁醇异丁醇 异戊醇 戊醇异戊醇硫甲基丙醇各种酵母发酵糖类结果Y1Y2Y3Y4葡萄糖+D-半乳糖+-+-麦芽糖+-+蔗糖+-+乳糖-+棉子糖-+蜜二糖纤维二糖海藻糖松三糖菊糖可溶性淀粉a-甲基-葡萄糖苷同化碳源葡萄糖+D-半乳糖+-+-麦芽糖+-+蔗糖+-+乳糖+-+棉子糖-+蜜二糖山梨糖纤维二糖海藻糖松三糖+菊糖-可溶性淀粉a-甲基-葡萄糖苷+卫茅醇+甘露醇D-木糖-琥玻酸柠檬酸各酵母菌其他生化生理特Y4Y1Y2Y3同化氮源（硝酸钾）同化乙醇液化明胶产酸试验产醋试验Y1 意大利酵母，Y2地生酵母，Y3酿酒酵母，Y4间型假丝酵母结果：分离耐酸耐高温酵母菌选择压排底醅或双轮底糟为试样，集菌培养基中加入少量底醅浸出液。