核酸检验基本技术

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1、第六章 核酸检验基本技术第一节 分子生物学基本知识、DNA 和 RNADNA是脱氧核糖核酸的英文缩写。DNA以核苷酸排列顺序形式储存遗传信息。DNA分子由4种核苷酸组成，由碱基互补维持DNA双螺旋结构。 在动植物、细菌和真菌中都含有DNA，但在病毒中不一定含DNA。DNA为长丝状分子相互纠缠，其溶液十分黏稠。它对紫外线有最强的吸收，通常用260nm波长测DNA溶液浓度，它在近中性环境中带负电荷，DNA变 性后0D值会升高。因DNA不溶于乙醇，常用二倍量乙醇沉淀DNA。在变性温度时，它的黏性突然降低。淬火是为了保持DNA单恋状态。DNA变性后溶液慢慢冷却，DNA会自动回复双螺旋结构。RNA是核糖

2、核酸的英文缩写，在大多数生物类型中，RNA起遗传信息传递作用并指导合成蛋白质，但 在一部分病毒中，RNA也是遗传信息的保存者。RNA分子中除了含有核糖而不是脱氧核糖外，凡DNA中出现胸腺嘧啶的地方都代之以尿嘧啶。二、DNA的复制和修复细胞分裂一次，染色体DNA就合成一次。DNA分子拆开成两条链，每一条单链按照碱基配对的原则合成另一条新的单链，成为半保留复制。 在合成DNA时限制性核酸内切酶不是合成DNA的必要条件。DNA多聚酶只能结合在一长段DNA单链的一小段局部双链结构上，才能顺利开始DNA合成。在DNA合成中单核苷酸分子必须顺序以共价链连接在已形成核酸链3?末端的羟基上。 在合成大声错误时

3、，DNA多聚酶会切除错误核苷酸，在那个位置上重新加一个正确核苷酸。 在人工合成DNA时，至加一种或两种三磷酸单核苷酸，那么和成就会停止在缺失的核苷酸位置上。 在大肠菌DNA损伤修复时填补缺口最重要的酶是DNA聚合酶I,而复制最主要的DNA聚合酶是DNA聚 合酶II。该酶的核心聚合酶中，具有3?-5?外切酶活性。DNA修复过程中尿嘧啶糖基酶系统不包括SI核酸酶。 逆转录酶的RNAaseH活性是一般DNA聚合酶所不具备的。三、转录在生物体内，DNA知道的RNA合成过程称为转录。它是按照储存在DNA尚的遗传信息合成。合成RNA时DNA双链也要解旋，解旋部位称启动子。大肠菌的RNA聚合酶有5个亚基，其

4、a亚基有启动子作用。四、翻译再合成各种不同RNA中，tRNA具有搬运氨基酸功能。构成核糖体骨架的是rRNA，而mRNA直接决定蛋白质的结构。4种核苷酸排列组成遗传信息,很撑蛋白质时转换成20种氨基酸的排列顺序,遗传信息的这种转换称 为翻译。3个核苷酸排列顺序代表一种氨基酸密码，表示蛋白质合成开始的密码有一种，DNA3个终止密码子分 别是 UAA、UAG、UGA。在细菌里，依靠rRNA和mRNA之间一段互补序列能发现蛋白质合成开始的位置。元和生物核糖体是由16SrRNA、23SrRNA和5SrRNA组成，在振和生物核糖体的五种主要的组蛋白中， H1 在进化中最不保守。在核糖体上，有2个位置上暴露

5、出mRNA分子相邻的2个密码子，当蛋白质合成进行到没有携带任何 一种氨基酸的tRNA与其对应，这说明合成蛋白质结束，并已开始同一种蛋白质分子的合成。 合成蛋白质后，决定其空间结构的是蛋白质的氨基酸排列顺序确定后，就能自动折叠卷曲呈一定的空间形状。第二节 分子生物学基本技术一、质粒DNA的分离、纯化和鉴定质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋 状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定 的拷贝数，并表示所携带的遗传信息。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如致病的能力和对抗

6、生素的抗性等。把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中进行繁殖和表达的工具叫载体。 细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个 人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必须序列，使分子量尽 可能减少，以便于基因工程操作。一个理想的克隆抗体大致应有下列一些特性： 分子量小、多拷贝、松弛控制型； 具有多种常用的限制性内切酶的单切点； 能插入较大的外源DNA片段； 具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大

7、小一般在110kb，如PBR322、PUC序列、PGE M序列和pBluescrip t （pBS）等。从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤： 培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。 含有治理细菌应在能够保存质粒的条件下培养，生长到足够数量时，加入抑制蛋白质合成的抗生素， 在细菌停止繁殖后质粒仍然还在复制，这样就可以提高质粒的收获量。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS ）和Tri ton X-100可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或Tri ton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌 染色体DNA比质粒大得多，易

8、受机械力和核酸酶等的作用而被切断呈不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而质粒的共价闭合环状DNA的两条链不会相 互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片产然在 一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在也液相中。离心除去断裂的染色体DNA和细胞的碎片，使用酚处理等方法除去包括核酸酶等的蛋白质，在使用乙 醇沉积等方法将质粒DNA从上清液中沉积下来，就可以获得高浓度的质粒溶液。细胞在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其他形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中 有一条链发

9、生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子，称开环DNA；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA。二、记忆组DNA的提取基因组DNA的提取是研究各种生物，包括病原微生物遗传特征的基本条件。利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，可用玻棒将其取 出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及地步，从而达到提取的目的。在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组的DNA时应量在温和 条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻

10、缓，以保证得到较长的DNA。一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上，否则酶切后两边都带合适末端的有效 片段很少。而进行RFLP和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段（20kb 以下），并可以保证含PCR所扩增的片段（一般2kb以下）。不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同；不同种类或同一种类的不同组 织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等又较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料 提取基因组DNA时，应考虑出去多糖和酚类物质。三、RNA的提取和c

11、DNA合成在病原微生物中，许多种类病毒的基因组由RNA组成，真核生物的组织或细胞中也存在着大量的RNA， 提取这些RNA，是了解生物和微生物中的生命过程，认识疾病的基本条件。细胞内总RNA制备方法很多，如异硫氰酸胍热本分发等。许多公司有现成的总RNA提取试剂盒，可快 速有效地提取到高质量的总RNA。分离的总RNA可利用mRNA3 ?末端含有多聚（A） +的特点，当RNA流经oligo （dT）纤维素柱时，在高 盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo（dT）纤维素上，然后逐渐降低盐浓度洗脱，在地盐溶液或 蒸馏水中，mRNA被洗下。经过两次oligo （dT ）纤维素柱，可得到较纯的mR

12、NA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70C可保存1年以 上。RNA还可以通过酶促反应逆转录合成cDNA来加以研究，将双链cDNA和载体连接，然后转化扩增，即 可获得cDNA文库，构建的cDNA文库可用于振和生物基因的结构、表达和调控的分析；比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一序列问题。cDNA合成及克隆的基本步骤包括用反转录酶合成cDNA第一链，聚合酶合成cDNA第二链，加入合成接 头以及将双链DNA克隆到适当载体（噬菌体或质粒）。四、DNA酶切及凝胶电泳限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上， 并切割双链

13、 DNA。它可分为三类，其中II类限制性内切酶在分子克隆和微生物鉴定中得到广泛应用。绝大多数II类限制酶识别长度为4个或6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列。与的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段，有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端 的DNA片段称黏性末端。利9用限制性内切酶的这些性质，可以对各种DNA结构进行限制性内切酶分析。DNA经限制性内切酶切割后，产生许多一定长度的片段，使用电泳的方法分离不同长度的片段，一种 DNA结构就能形成一种特征性的图形，称为DNA的电泳图谱，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA用 量为1|ig。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同，各种酶有其

14、相应的酶切缓冲液和最适反应温度（大多数 为 37C）。对质粒DNA酶切反应而言，限制性内切酶用量可按标准体系1|igDA加1单位酶，下滑12小时。 但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加23倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。在酶切图谱制作过程中，琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。 琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片段大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA 片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA （5500bp）效果较好，其分辨力极高，甚至相差1

15、bp的DNA片段就能分开。 聚丙烯酰胺凝胶通常采用垂直装置进行电泳。电泳完毕后，使用溴化一啶染色，DNA片段聚集的地方，在紫外线下可以显示发橙色荧光的条带。 如果电泳中使用了已知大小的DNA片段作为分子量标志，可以测量并计算出每一DNA片段的长度。结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析将这些片段排列起来，便可作出DNA的限制性内切酶酶切 图谱。DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点 组成，以直线或环状图式表示。需要注意DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性，只有严格 控制条件才能保证酶切图谱的准确性。第三节 探针和杂交技术DNA的双链结构解旋形成单链称为DNA的变性，变性后的DNA单链，仍可通过碱基配对重新次年工程 双链结构，称为复性。在复性过程中，不同来源的互补核苷酸系列形成稳定的杂合双链DNA的过程称为分子杂交。 带有可以识别标记的已知核苷酸系列称为探针，由于杂交过程的高度特异性，可以根据所使用的探针 测知对应系列的存在，这种方法称为杂交技术。核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性，因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克 隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因系列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用，而且在临床诊断上的