《DNA指纹的遗传分析试验报告》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DNA指纹的遗传分析试验报告（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、DN传旨纹的遗传分析【实验原理】“ DNA 指纹 是指可以利用DNA 差异来进行与传统指纹分析相似的身份识别。 DNA 指纹是以DNA 的多态性为根底，而卫星DNA 的发现那么是其最重要的奠基石。卫星DNA 是由一短序列即重复单位或核心序列屡次重复而成，因此也有人称其为可变数目串联重复序列variable numbers oftandem reprat， VNTR ,在人类基因组中存在多种由不同重复单位组成的卫星 DNA， 重复单位的碱基序列在不同个体中具有高度的保守性，而卫星 DNA的多态性那么来源于重复单位的重复次数不同，并形成了众多的等位基因。列如，人类1号染色体上的VNTR D1S80
2、,核心序列由16个核甘酸组成，拷 贝数在1441个之间，29种不同的等位基因。1984年Jefferys等人首次将别离的人源小卫星 DNA用作基因探针，同人类核 DNA 的酶切片段杂交，产生了由10多条带组成的杂交图谱，不同个体杂交图谱上带的位置就像指纹一样因人而异，因而Jefferys等人称之为DNA指纹图谱。产生 DNA 指纹图谱的过程叫做DNA 指纹分析，目前包括PCR、RFLP限制性内切酶酶切片段长度多态性和RAPD随机扩增多态性DNA等方法。DNA 指纹图谱的根本特点： 1多位点性：基因组中某些位点的小卫星重复单位含有相同或相似的核心序列。在一定的杂交条件下，一个小卫星探针可以同时与
3、十几个甚至几十个小卫星位点上的等位基因杂交。 2 高变异性：DNA 指纹图谱反响的是多个位点上的等位基因的特征，具有很高的变异性。发现两个无血缘关系个体具有相同DNA 指纹图谱的概率仅为5X10-19,因此，除了同卵双胞胎，几乎不可能有两个人的DNA指纹图谱完全相同。 3稳定的遗传性：DNA 指纹图谱中的谱带能够稳定遗传，杂合带遵守孟德尔遗传规律。子代DNA 指纹图谱中产生与双亲都不同的新带的概率基因突变仅在0.0010.004之间。DNA指纹图谱还具有体细胞稳定性，即用同一个体的不同组织如血液、肌肉、 毛发、 精液等的DNA 作出的 DNA指纹图谱是一致的。由于 DNA 指纹图谱具有这些显著
4、的特征，他已经成为最具吸引力的遗传标记。Jeffreys是第一个意识到DNA指纹可以建立个人身份识别系统的人，并且首先将其用于亲子鉴定，移民审查和凶杀侦破。1989 年该技术获美国国会批准作为正式法庭物证手段。此外， 它还被用于医生诊断及寻找与疾病连锁的遗传标记，探明动物种群的起源及进化过程，在作物的基因定位及育种上也有非常广泛的应用。【实验材料、仪器及试剂】1. 人类口腔细胞。2仪器：微量移液器，小型离心机，恒温水浴锅，漩涡振荡器，PCR仪，电泳仪，电泳槽，透射式紫外分析仪(或凝胶成像仪)。枪头，1.5mL，0.2 mL离心管，棉签，使用前均需121c高温灭菌3 试剂：NaCl， 琼脂糖，
5、溴化乙锭，Na2-EDTA， SDS， Tris， ProteinaseK ，冰醋酸，溴酚蓝，二甲苯腈蓝，蔗糖，甘油，DNA 相对分子质量标记，Chelex 100树脂(Bio-Rad) ， PCR pre-mix(TaKaRa)。4溶液配制：( 1) 5% Chelex 树脂： Chelex 100(Bio-Rad) 0.5g、 50mmol/L Tris-HCl 10mL、 用 4mol/L NaOH 调 pH 至 11， 室温可保存3个月， 使用前充分混匀。(2) 2.0%琼脂糖凝胶：称2.0g琼脂糖放入250ml三角烧瓶，参加1X TAE溶液100mL微波炉加热溶解，冷却至60c左右参
6、加1 g/mL澳化乙锭 ( EB) ，缓慢混匀后倒胶板。(3)澳化乙锭(EB):用无菌水配制5mg/mL储藏液，工作浓度1仙g/mL。注意；溴化乙锭为诱变剂，有致癌作用。配制、稀释和染色时必须戴手 套。(4) 0.5mol/L EDTA(pH8.0): Na2-EDTA 18.61g、NaOH 2g,蒸储水定容 至100mL,室温保存。(5) 10 X TAE 电泳缓冲液：Tris 48.4g、冰醋酸 11.42mL、0.5mol/LEDTA(pH8.0) 20mL,蒸储水定容至1000mL,室温保存。(6) 10x上样缓冲液(Loading dye):澳酚蓝0.25g、二甲苯月青蓝 0.25
7、g 蔗糖50.00g (或甘油50mL),用60mL无菌水(用甘油 50mL时，49mL) 溶解上述试剂，再定至100mL，室温保存即可。(7) 10%SDS: SDS 10g用无菌水溶解后(可加热)，定容至100mL,室 温保存。(8)蛋白酶K溶液：20mg/mL蛋白酶K水溶液5mL、10%SDS 1mL、 无菌水94mL,冰箱冷藏。( 9)无菌水：蒸馏水或去离子水，高温灭菌。(10) 1mol/L Tris-HCl(pH8.0):将 12.1g Tris 溶解在 80mL 蒸储水中，加盐酸调节pH 至 8.0，加蒸馏水定容至100mL。5引物Primer1： 5 -GAAACTGGCCTC
8、CAAACACTGCCCGCCG-3 Primer2： 5 -GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC-3 【实验操作】1 收集DNA 样本( 1) 先漱口， 然后用灭菌的牙签充分擦刮口腔内壁，将该牙签放入1.5mL装有 1mL 无菌水的小离心管中，使粘附在牙签外表的口腔细胞悬浮其中(以能看到悬浮物为好)。震荡10s， 10000 r/min 离心1min。(2)从离心管中吸出970仙L无菌水，注意不要吸到沉淀。(3)向离心管中参加 200仙L 5% Chelex 100,震荡10s混匀。(4)参加2L蛋白酶K,混匀，56c保温5min。(5)剧烈震荡10s沸水浴8min。(
9、 6) 10000r/min 离 心 3min ，离 心管 中溶液 分成 上下 两层： 下层为 Chelex100和细胞碎片的沉淀，上层溶液含 DNA分子，可以直接用作 PCR 模板。此 DNA 样本可在4或-20保存，必要时可在使用前再次加热并离心，使管内物质分层。2. PCR扩增D1S80等位基因(1)每个人用记号笔在0.2mL PCR管上做好标记。(2)准备冰盒，开始反响前尽量使 PCR管保持在冰上。(3)依次参加以下成分，配制25 nL体系的PCR反响溶液：PCR pre-mix12.5 仙 L引物11仙L引物21仙L口腔细胞DNA样本10 nL加无菌水至总体积25uL。4)轻弹管壁，
10、混匀溶液。(5)离心10s,使管壁上的液滴落下。(6)按以下程序开始PCR反响：94，1 min94，15s68，15s72，15 s30 个循环72，10min4暂时放置，直至开始电泳3. PCR扩增产物鉴定与D1S80等位基因分析1)准备冰盒。(2)取出完成反响的PCR管，放冰上待用。(3)取出10pLD1S80 PCR扩增产物放入0.5mL离心管。(4)参加2山上样缓冲液。( 5)轻弹管壁混匀，再瞬时离心，使管壁上的液滴下落。(6)用1kAE电泳缓冲液配制2.0%琼脂糖电泳凝胶。(7) 60V预电泳12min。(8)在凝胶上选一孔加6 pLDNA相对分子质量标记(DNA100bpLadd
11、er) (9)每人将刚刚准备好的10pLD1S80 PCR扩增产物+2 uL的上样缓冲液各自参加凝胶样孔，注意不要有气泡进入。(10) 60V 电泳 3040min。(11)取出凝胶用清水漂洗510min。( 12) 凝胶用紫外分析仪观察，记录每个个体的DNA 条带数目及其位置。4.观察和分析D1S80多态性。四、结果与分析本次实验所选择的方法是D1S80 指纹图谱分析的常用方法。人群中D1S80座位的杂合率约为86%。从理论上讲，可能存在 435种不同的等位 基因组合。利用D1S80座位两侧序列设计的引物(Kasai et al, 1990),通过PCR 反响，很容易确定特定个体的D1S80
12、 等位基因构成，纯合体只有一条DNA 带，而杂合体有两条不同的DNA 带。1 将小组的电泳结果拍照，附于下：2 .根据电泳结果，填写D1S80等位基因分析结果D1S80 DNA指纹特征小组成员大小/bp长度重复数杂合/纯和小组成员A60029纯和小组成员B 150022纯和小组成员C55025纯和注：因为重复数为l的DIS80 PCR产物长161bp,所以，重复数每增加一个, 序列增加长度16 bp。据此可以催算：重复数=1+ PCR产物大小161 /16 【讨论】1 .本人的条带是第二条，不是很清楚，原因可能是样品浓度过稀，也就是一 开始刮取的口腔内壁细胞太少了，水浴时又洒了少许，以至于后来
13、PCR也没扩增出。还有一个可能的原因就是 DNA的纯度不够，带有太多的杂质， 从而跑电泳时DNA被杂质阻滞，因此效果不太好。2 .跑出的条带上的DNA是人源小卫星DNA DIS80的PCRT物。它是一种 具有多位点、高变异、稳定遗传的 DNA分子，而且每个人的DIS80DNA中重 复序列的数目是不同的，所以它比传统的指纹分析更方便、快捷、准确。3 .实验过程中，有两次水浴的步骤，一定要注意将离心管的盖子盖紧，由于 离心管是灭菌的，所以如果盖子盖的不紧，就会从沸水浴中炸开，自己就是 这种情况，导致条带不清楚。思考题：1 .用PCR、RFLP、RAPD方法产生DNA指纹图谱各有哪些利弊？答：PCR
14、作为现代生物学研究的一种常用方法，具有特异性高、灵敏度高、 简便节约、经济的优点；但是它最大的缺点是对不同的片段条件不同，所以 很难掌握，而且必须要得到目的基因片段。RFLP这种方法比拟稳定，但 RFLP实验操作繁琐，检测时间长，本钱 较贵，不太适合大规模的分子育种。PAPD相对RFLP来说，更加省时省力，不需要进行 DNA多种酶切、 转膜以及探针的制备等多个步骤，但是它不能用来测定多态性是由父本还是 母本产生的，而 RFLP这种技术可以做到，而且 PADA这项技术源于PCR2 .如果一个个体的两个D1S80等位基因之间相差一个重复，是否仍然可以 用琼脂糖凝胶电泳检测，为什么？答：我认为假设DIS80等位基因之间只差一个重复序列的话， 就不能使用琼脂 糖凝胶胶电泳检测了。因为琼脂糖凝胶电泳的原理是利用琼脂糖的网状聚 合结构，分子量的DNA不易穿过，泳动距离就近，反之亦然。但是一个 重复序列也只有166bp。实在太小了，琼脂糖凝胶不能将它们别离。
