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1、溶剂辅助风味蒸发法与顶空-固相微萃取法结合分析白酒酒醅中挥发性风味成分宫俐莉;李安军;孙金沅;李贺贺;孙啸涛;黄明泉;郑福平;孙宝国【摘要】采用溶剂辅助风味蒸发法(solvent-assisted flavor evaporation,SAFE) 与顶空-固相微萃取法(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)两种 萃取方法,利用气相色谱-质谱联用技术(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)结合保留指数、标准品比对，对古井酒醅中的挥发性风味成 分进行分析.共鉴定出120种挥发性化合物,包括酯类66
2、种、醇类13种、醛酮类9 种、缩醛类1种、脂肪酸类15种、醚酚类6种、含苯环类3种、烯烃类4种及 其他类化合物3种.SAFE法和HS-SPME法萃取出的挥发性风味成分有一定差 异,HS-SPME法对于酯类物质萃取效果较好,SAFE法对于醇类、脂肪酸类物质萃取 效果更佳,两者互补分析获得了较全面的分析结果.期刊名称】 食品与发酵工业年(卷),期】 2016(042)009【总页数】9页(P169-177)【关键词】 溶剂辅助风味蒸发;顶空-固相微萃取;酒醅;气质联用;挥发性风味成分【作 者】 宫俐莉;李安军;孙金沅;李贺贺;孙啸涛;黄明泉;郑福平;孙宝国【作者单位】 北京工商大学,北京市食品风味
3、化学重点实验室,北京,100048;安徽古井贡酒股份有限公司,安徽亳州,236000;北京工商大学,北京市食品风味化学重点实验室,北京,100048;北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京,100048;北京工商大学,北京市食品风味化学重点实验室,北京,100048;北京食品营养与人类健康高 精尖创新中心,北京,100048;北京工商大学,北京市食品风味化学重点实验室,北 京,100048;北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京,100048;北京工商大学, 北京市食品风味化学重点实验室,北京,100048;北京食品营养与人类健康高精尖创 新中心,北京,100048;北京工商大学,北京
4、市食品风味化学重点实验室,北京,100048; 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京,100048;北京工商大学,北京市食品 风味化学重点实验室,北京,100048;北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北 京,100048【正文语种】中 文中国白酒以纯粮或粮谷为原料，采用天然微生物自然接种制曲、固态糖化发酵、固 态甑桶蒸馏、陶坛储存等工艺流程酿造，是我国的国酒1。酒醅在发酵过程中产 生的风味物质，与成品白酒的风味密切相关，因此也是众多研究人员关注的对象。 目前国内对于酒醅的研究，主要集中在酿酒微生物的探索2-3、酒醅的理化因素 4-6等方面，而对于酒醅中挥发性物质的研究相对较少，范文来
5、等8于2008年 应用顶空-固相微萃取技术测定发酵浓香型酒醅的微量成分，判定酒醅中重要的挥 发性化合物是己酸乙酯、己酸、辛酸乙酯等。赵爽等9于2013年对顶空-固相微 萃取技术萃取酒醅微量挥发性成分的条件进行了优化，在整个酒醅的发酵过程中共 检出105种微量挥发性成分，得到发酵过程中微量挥发性物质种类的个数和相对 含量随时间的变化规律。与酒醅相比较而言，对于成品白酒挥发性风味成分的研究 开展的更早也更为充分，目前已有直接进样法、固相萃取法、固相微萃取法、液液 萃取法、搅拌棒吸附萃取法、同时蒸馏萃取法、顶空进样法、热脱附法、超临界二 氧化碳萃取法等多种前处理方法被用于白酒的相关分析研究工作中10
6、。溶剂辅助风味蒸发法(solvent-assisted flavor evaporation,SAFE )是在高真空条件 下，利用水或其他有机溶剂辅助挥发性风味物质快速蒸发，从而分离难挥发、非挥 发组分，是一种相对温和的挥发性成分提取方式，且一般被认为提取的香味更接近 真实样品10。顶空-固相微萃取法（headspace solid-phasemicroextraction,HS-SPME）是目前国际上比较流行的检测微量挥发性成分的方法， 属于非溶剂型选择性萃取法，且样品用量较少10。两种方法各有优点，但SAFE 法操作较复杂，而HS-SPME法操作虽较简单，但是被萃取物质的成分组成不一定 与
7、顶空组成一致，且萃取效果会受到较多因素的影响，如萃取头、萃取时间、萃取 温度等。目前采用SAFE法对白酒酒醅中挥发性风味成分进行分析的工作尚未见文献报道。 本实验采用 SAFE 法与 HS-SPME 法结合（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）对酒醅中挥发性风味成分进行分析，一方面考察SAFE方 法分析酒醅中挥发性成分的可行性，另一方面通过不同方法的对比与互补，较为全 面地分析古井酒醅中的挥发性风味成分，以期为酒醅风味和白酒风味的相关分析提 供数据支持。1.1 材料与试剂酒醅样品（由古井贡酒酒厂提供）。二氯甲烷（分析纯，重蒸处理）、无水硫酸钠（
8、分析纯,120 C烘箱中烘烤5 h,干燥 器中冷却备用），国药集团化学试剂有限公司；C6-C30的正构烷烃（色谱纯），质量 分数99.0%,美国Sigma Aldrich公司；液氮，质量分数99.99%，北京锐志汉 兴有限公司；标准品：2-辛醇（内标）、乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯 辛酸乙酯、癸酸乙酯、苯乙酸乙酯、苯丙酸乙酯、壬酸乙酯、油酸乙酯、2,3-丁二 醇、乙酸、己酸、辛酸、丁酸、乳酸、苯甲醛、苯乙醛、4-甲基愈创木酚、4-乙 基愈创木酚，质量分数均为99.99%，美国Sigma Aldrich公司。1.2 仪器与设备溶剂辅助风味蒸发装置(定制加工，图1),北京肯堡博美玻璃仪器
9、厂；XDS5复合 分子涡轮泵，英国Edwards公司；SPME萃取手柄、65 pm PDMS/DVB萃取头， 美国Supelco公司；N-EVAP111 12位干浴氮吹仪，美国Organomation Associates公司；7890B-597引气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司。1.3 方法1.3.1 SAFE法提取酒醅挥发性风味成分参考相关文献5，选择酒体感官最优的中层醅10 g，粉碎机粉碎后装入圆底烧瓶， 加入30 mL重蒸二氯甲烷，于20工恒温水浴中搅拌萃取1h，倾倒出萃取液，重 复该步骤3次，收集萃取液90 mL。加入6 g无水硫酸钠于冰箱中4 C静置12 h 除水，过滤
10、得澄清黄色液体。SAFE装置循环水浴温度及恒温水槽均设置为20 C,在冷阱中加入液氮，开启分 子涡轮泵，待系统的真空度达到1x10-6 MPa时，缓慢打开滴液漏斗旋塞，控制 样品液的流速，使其缓慢、均匀地滴入蒸馏瓶中，萃取约40 min。室温下，待重 蒸二氯甲烷提取液自然融化以后，再加入6g无水硫酸钠除水，于冰箱中4C静 置12 h后旋转蒸发至5 mL，氮吹至0.5 mL备用。为确保实验的准确性，相同条 件下进行3次平行实验。1.3.2 HS-SPME法提取酒醅挥发性风味成分参考赵爽等9相关研究中确定的最优条件，称取10 g酒醅于20 mL顶空瓶中， 将其置于60 C恒温水浴中平衡30 min
11、，固相微萃取40 min后迅速插入气质联 机进样口中解析5 min。为确保实验的准确性，相同条件下进行3次平行实验。1.3.3气相色谱-质谱(GC-MS)条件气相色谱(GC)条件：采用DB-WAX毛细管柱(30 mx0.25 mm,0.25 pm)；载气 为He，流速为1 mL/min ;色谱柱升温程序为：起始柱温35 C,保持3 min , 以5 C/min升到100 C,保持3 min，然后以5 C/min升到150 C,最后以10 C/min升到230 C,保持3 min ;进样口温度250 C,不分流进样，进样量1 pL。质谱(MS)条件：电子电离(electron ionizatio
12、n , EI)源，电子能量70 eV,离子源 温度230 C,四极杆温度150 C,扫描模式全扫描，质量扫描范围m/z 25 350, 调谐文件为标准调谐。1.3.4 挥发性风味成分的定性定量定性：数据处理由GC-MSD化学工作站完成，化合物经检索与NIST 11谱库相匹 配，列出匹配度大于80的结果，进一步与标准品比对，再通过C6-C30正构烷烃 的GC保留时间计算保留指数，参考其文献值，得出定性结果。RI测定方法：在色谱条件相同的情况下，以一系列正构烷烃(C6-C30)作为标准进 行GC-MS分析，并根据公式计算待测物i的保留指数(tnvtivtn + 1)。式中：RI,保留指数；n，碳原
13、子数；tn，碳原子数为n的正构烷烃的保留时间； tn + 1,碳原子数为n + 1的正构烷烃的保留时间；ti，样品i的保留时间。 定量：根据化合物的峰面积,通过面积归一化法确定挥发性成分的相对百分含量。1.3.5 两种方法检出限、定量限、回收率的比较 根据定性结果,取一定量1.1中标准品,用无水乙醇配制成单标,混合成混标,将 标准溶液逐级稀释后采用 1.3 所述两种方法进行 GC-MS 分析,作检出限、定量限、 回收率实验。当信噪比大于3时视该质量浓度为检出限,信噪比大于10时视该质 量浓度为定量限。SAFE法和HS-SPME法共检测出120种挥发性风味物质，结果见表1,在检测出 物质的种类、
14、相对百分含量上均有明显差别,结果见图2、图3。2.1 两种方法检出限、定量限、回收率比较 基于定性结果,从两种方法均检测到的物质中选取浓香型白酒四大酯四大酸、相对 百分含量相差较大(10倍以上)、对风味有重要贡献31的代表性化合物共20种, 进行两种方法检出限、定量限、回收率的测定。结果如表 2 所示，两种方法的回 收率都在80% 120%之间，表明两种方法用于萃取酒醅中挥发性风味化合物均可 行。对于酯类物质而言，本实验选取的代表性酯类物质采用两种方法的检出限和定量限 除部分物质较相近外，HS-SPME方法均稍低于SAFE方法，且结合表1中信噪比 检测数值，对于大部分酯类而言，HS-SPME法
15、信噪比数值更大。这进一步说明该 实验中选择的65pmPDMS/DVB萃取头对酯类物质有很好的吸附效果，在重点对 酒醅中酯类物质进行研究时，采用此萃取头进行HS-SPME提取是更为适宜的方法。 对于醇类、酸类物质而言，SAFE方法更优。且从定量的角度考量，SAFE方法整 体而言较HS-SPME方法能更好的还原酒醅中挥发性风味物质的真实情况，更适合 进行定量分析。2.2 酯类酯类化合物经SAFE法检测出49种，经HS-SPME法检测出48种，两种方法均 检测到31种。虽然这两种方法在萃取物质种类的数量上没有太大差别，然而就峰 面积百分比而言，HS-SPME法检测到的酯类物质相比较其他种类物质而言含
16、量较 高（图 3），可能是因为本实验所采用的萃取头对酯类组分的萃取效果较好。 酯类化合物是浓香型白酒固态发酵酒醅中最重要的微量香味成分17，实验结果显 示其总峰面积百分比最大。通常而言，白酒中酯类物质主要来源有二：一是由酒醅 蒸馏出酒时一定温度下脂肪酸和醇类发生酯化反应得来18，例如酒醅中大多数脂 肪酸乙酯类物质；二是由产酯酵母代谢产生19。产酯酵母具有较强的酯合成能力， 能代谢产生大量的酯类物质，如乙酸乙酯等，赋予大曲酒浓郁的芬芳20。通过两 种方法均检测到且相对百分含量较高的物质中，己酸乙酯（水果香）、乳酸乙酯（果 香、花香）、辛酸乙酯（烤面包香）及丁二酸二乙酯（清淡而舒适的葡萄香8）这些物质 主要为酒醅提供了水果香的香气骨架，对形成浓香型白酒的典型风格起着关键作用 21。其中相对百分含量最高的己酸乙酯已被判定为浓香
