《小鼠 BPI N 端功能基因片段的克隆及其表达产物在胞内》由会员分享，可在线阅读，更多相关《小鼠 BPI N 端功能基因片段的克隆及其表达产物在胞内（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、小鼠 BPI N 端功能基因片段的克隆及其表达产物在胞内杀菌作用的研究1李丽，冯颖，吕喆，孔庆利，刘振龙，赵冬，高燕，王炜*，安云庆*首都医科大学免疫学系，北京（100069）E-mail：摘要：目的：克隆小鼠 BPI36-259基因片段，转染细胞获得具有杀菌作用的目的抗菌蛋白。方法： 采用生物信息学方法，构建PUC57-muBPI1-281 质粒；PCR 扩增获得muBPI36-259 基因片段，制备 pcDNA3.1 (+)-muBPI36-259 重组质 粒； 采用电穿孔 法将上述重组 质粒转染 RAW264.7 细胞 ， Western-blot法检测目的蛋白在胞内的表达；建立胞内杀菌
2、实验模型，检测muBPI36-259目的蛋白对 胞内寄生菌（伤寒杆菌）的杀伤作用。结果：muBPI36-259目的蛋白在RAW264.7细胞内成功表达， 对胞内寄生菌G- 伤寒杆菌具有杀伤作用。结论：成功克隆了小鼠BPI36-259 基因片段，转染 RAW264.7细胞获得具有生物学活性目的抗菌蛋白。 关键词：杀菌/渗透性增强蛋白；RAW264.7细胞；伤寒杆菌中国图书分类号：R392杀菌/渗透性增强蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein，BPI)是广泛存在于人、牛、 猪等多种哺乳动物多形核中性粒细胞中的一种 55KD 的阳离子抗菌蛋白1
3、,2。因其兼备中和内毒素 和杀伤革兰氏阴性菌(GNB)双重作用而受到关注3。我们成功克隆了人 BPI 基因和人 IgGFc 基因， 制备了 AAV2-BPI-Fc1 重组病毒，将其转染小鼠两周后，可使小鼠对致死量 E.coli 感染攻击产生 良好的保护作用4,5。人 BPI 和 Fc1 为异源性蛋白，可引发小鼠免疫应答产生相应抗体阻断目的 抗菌蛋白的杀菌作用。因此，无法长期观察基因导入小鼠对 GNB 感染的抵抗作用，难以确定抗感 染基因转染能否为临床感染高危人群提供一种有效预防 GNB 感染的方法和途径。为此，本研究拟克隆编码小鼠 BPI 功能片段的基因（muBPI36-259）和编码小鼠 I
4、gGFc 基因（Fc）， 制备 AAV2-muBPI36-259-Fc1 重组病毒载体，并通过观察目的基因产物在小鼠体内能否引起免疫应 答和基因转染小鼠对致死量 E.coli 感染攻击保护作用持续的时间，以确定人 BPI-Fc1 嵌合基因转 染在临床感染高危人群中应用的可行性。采用生物信息学方法对小鼠 BPI 和人 BPI 基因进行同源分析，预测小鼠 BPI 功能片段，获得 muBPI36-259 基因片段，构建 pcDNA3.1 (+)-muBPI36-259 重组质粒。然后采用电穿孔法将上述重组质 粒转染 RAW264.7 巨噬细胞，通过胞内杀菌试验6检测目的抗菌蛋白的杀菌活性。1. 材料
5、与方法1.1 材料BamH、Kpn 限制性内切酶，T4 DNA 连接酶，Go Taq polymerase 购自 Promega 公司；Qiagen 胶 纯化回收试剂盒，购自北京欣经科生物技术有限公司；Tiangen 质粒小提试剂盒，购自天根生化科 技北京有限公司；威格拉斯大提质粒试剂盒购自威格拉斯生物技术北京有限公司；伤寒杆菌（50071）为本室保存；RAW264.7 细胞为小鼠单核巨噬细胞系（ATCC Number：CRL-2278）， 购自中国协和医科大学细胞中心；绿色荧光增强蛋白表达质粒 pEGFPN1 为本室保存；pcDNA3.1 (+) 质粒购自 Invitrogen 公司；兔抗鼠
6、 BPI 多克隆抗体为本室制备、羊抗兔 IgG 单克隆抗体购自华美 生物工程公司。1本课题得到教育部博士学科点专项科研基金（20040025002）和北京市自然科学基金项目（7082016）资助。- 1 -1.2 方法1.2.1 小鼠 BPI 功能片段的预测采用 ClustalW 软件对 BALB/c 小鼠和人 BPI 氨基酸序列进行比对，结果显示小鼠 BPI 氨基酸 序列与人 BPI 氨基酸序列 53%相同，相似度高达 71（图略）。采用 SMART 软件预测分析 BALB/c 小鼠 BPI 氨基酸结构域，发现小鼠与人 BPI 结构域高度相似，其 N 端第 127 位氨基酸为信号肽 序列，N
7、 端第 36259 位氨基酸是具有中和内毒素和杀菌作用的功能片段，C 端第 274478 位氨 基酸序列与 N 端结构域氨基酸序列相似度小于 20%（表略）。由上海生工生物工程技术服务有限 公司化学合成小鼠 BPI1-281 基因片段，构建 PUC57-BPI1-281 质粒。1.2.2 小鼠 BPI36-259 目的基因片段的扩增以 PUC57-BPI1-281 质粒 DNA 为模板，在引物 P1（5 cgg ggt acc atg atc tcc cag aag ggt ctg gac ttc g 3 ）和引物 P2（5 cgc gga tcc tta gtg tcc cct cca ga
8、a aaa ctc3）作用下，采用 PCR 法扩增编码小 鼠 BPI36-259 抗菌蛋白的 muBPI36-259 基因片段。反应条件为：95预变性 2min，95变性 45s, 59.8退火 45s，72延伸 51s，72充分延伸 5min，410min 终止反应，30 个循环。1.2.3pcDNA3.1（+）-muBPI36-259 重组质粒的构建和鉴定用 BamH 与 Kpn 分别双酶切 pcDNA3.1 (+)质粒和 muBPI36-259 基因片段。取上述酶切产物以 3：1 比例混合后，通过连接反应构建 pcDNA3.1（+）- muBPI36-259 重组质粒。将 pcDNA3.
9、1（+）-muBPI36-259 重组质粒转化 E.coli DH5，挑选阳性克隆菌小提质粒，进行酶切鉴定和测序分析。1.2.4pEGFP-N1 对 RAW264.7 细胞的转染及其条件优化 采用电穿孔法将绿色荧光增强蛋白表达质粒 pEGFP-N1 转染 RAW264.7 细胞。取不同剂量pEGFP-N1 质粒 DNA（5、10、15、20、25、30g）分别与 0.2mlRAW264.7 细胞（2107 个/ml）悬液在 Eppendorf 管中混匀，4静置 10 分钟后将管内细胞悬液置于电转杯中，用不同电压和脉 冲时间进行电转染条件优化选择。然后将细胞混合液加入六孔板中置于 CO2 孵箱中
10、培养，并在培 养第 24h，48h 和 72h 在荧光和普通光学显微镜下观察各孔细胞计数转染率。1.2.5pcDNA3.1 (+)-muBPI36-259 重组质粒对 RAW264.7 细胞的转染实验分为三组：pcDNA3.1 (+)-muBPI36-259 重组质粒转染实验组、pcDNA3.1 (+)空质粒转染对照 组和空白细胞对照组。取 0.2ml RAW264.7 细胞悬液（2107 个/ml）和最适剂量（20g）质粒 DNA 置于 Eppendorf 管中混匀；4静置 10 分钟取管内细胞悬液置于电转杯中，选择最佳电压 和脉冲条件电击穿孔；将杯中细胞混合液置于六孔板中，各孔补加 2ml
11、 改良 RPMI1640 培养液 后，将六孔板置于 CO2 孵箱 37培养 48 小时，用于伤寒杆菌感染和细胞内目的蛋白的检测。1.2.6muBPI36-259 目的蛋白在 RAW264.7 细胞内的表达取 15l pcDNA3.1 (+)-muBPI36-259 重组质粒转染后培养 48 小时的 RAW264.7 细胞裂解液与 15l2SDS 电泳上样缓冲液混匀后（10l）上样；以兔抗鼠 BPI 抗血清（1：1000 稀释）作为一抗， 以 HRP 标记的羊抗兔 IgG 抗体（1：500 稀释）为二抗；Western-blot 检测 RAW264.7 细胞内 muBPI36-259 目的蛋白的
12、表达情况。1.2.7伤寒杆菌对 RAW264.7 细胞的感染和胞内菌落计数取 50l 伤寒菌液（4105 个/ml）分别加入六孔板培养的 RAW264.7 细胞、pcDNA3.1 (+)空质粒转染的 RAW264.7 细胞和 pcDNA3.1(+)-muBPI36-259 重组质粒转染的 RAW264.7 细胞中；将六孔板 1000rpm 离心 10 分钟后，37培养 25 分钟，弃上清，PBS 洗 3 次；各孔加入 2ml 改良 RPMI1640 培养液（庆大霉素终浓度为 100g/ml），37培养 1 小时后弃上清，再加入 2ml 改良 RPMI1640 培养液（庆大霉素终浓度 15g/m
13、l），37培养过夜；吸弃六孔板中培养上清液，用0.1%的吐温 20 裂解 RAW264.7 细胞，采用平板倾注法检测细胞裂解液中菌落数。1.2.8伤寒杆菌在电穿孔前/后 RAW264.7 细胞内生长情况的检测将正常 RAW264.7 细胞和电穿孔前后培养 1 天，2 天，3 天的 RAW264.7 细胞分别与伤寒杆菌 共育 25 分钟，洗涤去除胞外细菌后继续培养，并在继续培养的第 2h、4h、8h、16h 取一定量细胞 裂解，采用平板倾注法检测裂解液中菌落数，观察伤寒杆菌在 RAW264.7 细胞内的生长情况。2. 结果2.1 小鼠 BPI36-259 基因片段的 PCR 鉴定以 PUC57-
14、BPI1-281 质粒 DNA 为模板， P1/P2 为引物，采用 PCR 法扩增小鼠 BPI36-259 基因片 段。取 PCR 产物 5l 电泳后在琼脂糖凝胶 500bp750bp 间可见一条粗大的 DNA 条带（669bp）， 与实验预期结果相符（图略）。2.2pcDNA3.1 (+)-muBPI36-259 重组质粒酶切和测序鉴定从 pcDNA3.1 (+)-muBPI36-259 重组质粒转化阳性克隆菌中提取质粒 DNA，用 BamH和 Kpn酶切质粒 DNA 后，电泳鉴定结果如图 1A/B 所示：酶切前重组质粒 DNA 在凝胶上出现一 条与预期结果大小相符的条带（6097bp）；酶切后质粒 DNA 在凝胶上出现一条与 pcDNA3.1 (+)质 粒大小（5428bp）相符的条带和一条与小鼠 BPI36-259 基因片段大小（669bp）相符的条带。双酶切 鉴定后重组质粒用引物 T7 测序，结果与基因库中小鼠 BPI36-259 基因序列完全相同（图略）1 2(B)12- 3 -7000bp5500bp3500bp2000bp1000bp500bp重组质粒重组质粒 DDNNAA(66
