《糖链的序列测定!!!》由会员分享，可在线阅读，更多相关《糖链的序列测定!!!（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、糖链的序列测定一高碘酸氧化法及Smith降解法实验 生化分子 糖链的序列测定高碘酸氧化法(http:/ 或甲酸反应定量进行,每开裂1个CC键消耗1分子高碘酸通过测定高碘酸的 消耗量及甲酸的释放量,可以判断糖苷键的位置,直链多糖的聚合度,分支多糖的 分支数等.Smith降解是将高碘酸氧化产物还原后酸水解，再鉴定水解产物，从而 推断糖苷键的位置与分支点等.以葡萄糖为例，以12或1 4位键合的糖基经 高碘酸氧化,平均每个糖基消耗1分子高碘酸,且无甲酸释放;13位键合的糖基 不被高碘酸氧化;16位键合的糖基或非还原末端糖基经高碘酸氧化,消耗2分 子高碘酸同时释放1分子甲酸.【实验原理】 高碘酸可以选择
2、性地氧化和断裂糖分子中连二羟基或连三羟基处，生成相应的多 糖醛、甲醛或甲酸。反应定量地进行，每开裂个 C-C 键消耗一分子高碘酸。 通过测定高碘酸消耗量及甲酸的释放量，可以判断多糖分子中糖苷键的位置、类 型、多糖的分枝数目和取代情况等。【实验材料】1. 实验器材紫外分光光度计。2. 实验试剂溴甲酚蓝指示剂：0.1克溴甲酚蓝溶于250ml蒸馏水中(含1.43毫升0.1mol/L 氢氧化钠)。30mmol/L高碘酸钠溶液。高碘酸钠 基本信息 中文名称：高碘酸钠 英文名称:Sodium periodate 中文别名：过碘酸钠;偏高碘酸钠英文另0 名：Sodium Metaperiodate; Sod
3、ium Metapriodate; Sodium (Meta)Periodate; Sodium Tetroxoiodate(Vii); Sodium meta periodateCAS:7790-28-51EINECS:232-197-6分子式:NaI04分子量:213.8918高碘酸简介中文名称：高碘酸英文名称：periodic acid正高碘酸英文另 0名:pentahydroxy-lambda5-iodane oxide1CAS No. : 10450-60-9分子式：H5IO6分子量：227.94理化特性：主要成分：纯品外观与性状：无色或白色结晶，无臭，有潮解性熔点(C): 122沸
4、点(C): 140(分解)相对蒸气密度(空气=1) : 7.9溶解性:溶于水、乙醇，微溶于乙醚主要用途：用作氧化剂。高碘酸钠制备：氯气氧化法将碘在水介质中，通入氯气进行氧化生成高碘酸，经分离杂质后，加入氢氧化钠溶液中和至 pH23，生成高碘酸钠溶液，再经提纯、分离杂质、蒸发浓缩、冷却结晶、离心分离、干燥，制得高碘酸 钠成品，其反应方程式：HIO4+NaOHNaIO4+H2O乙二醇。(4) 0.01mol/L氢氧化钠溶液。【实验操作】1.制作标准曲线：取6支干燥试管，按下表操作管号012345高碘酸钠(ml)00.51.01.52.04.0蒸馏水（ml）4.03.53.02.52.00各取0.1
5、 ml，定容至25 ml ,在223nm处测定光密度A223横坐标为高碘酸钠毫摩尔数，纵坐标为光密度值，绘制标准曲线。2. 样品测定称取多糖样品25mg，用少量水溶解，加入30mmol/L高碘酸钠溶液，定容至 25ml，置于暗处，室温下进行反应，于0,6,12,24,36,48.小时间隔取样0.1 ml ,蒸馏水稀释250倍后，使用紫外分光光度计在223nm处测定光密度。至光密度值达一稳定值时，加乙二醇破坏过量的高碘酸以终止反应。由此光密度值根据标准曲线计算出高碘酸的消耗量。取2ml上述反应溶液，测定甲酸的生 成量。剩余部分进行Smith降解。3. 甲酸测定：取2ml上述反应溶液，加一滴溴甲酚
6、蓝作指示剂，用0.01mol/L氢氧化钠溶液 滴定甲酸的释放量。【注意事项】为避免发生超氧化，反应溶液的pH值应控制在35 ,而且一定要在低温、避光 处进行实验 生化分子 糖链的序列测定一Smith降解法(http:/ 定的多羟基化合物。然后进行适度的酸水解，用纸层析鉴定水解产物，由水解产 物可以推断多糖各组分的连接方式及次序。以葡聚糖为例，其反应式如下图：以1-2位键合的糖基经高碘酸氧化，平均每个糖基仅消Smith降解是将高碘酸氧化产物用硼氢化合物（如硼氢化钾或硼氢化钠）还原成稳 定的多羟基化合物。然后进行适度的酸水解，用纸层析鉴定水解产物，由水解产物可以推断多糖各组壬 12 、3iwssl
7、$l、8 Smith霸讪巾ni苗。:171=&辟|311 wwwQCTi 口 hmm A tif fib V并曹淵料然富矗WWW - _-nlbl壬 13 iosssnSmithCM止uot 宀呛HQHyq- I ATFOX Grol 常爲寻 卩U3OHH2OHO!OH+CH2OHHOHOH牛料n衣多=：殳念井页j圉iXiAii.riAi.bbiOD .匚口EKBHOHCH,OHo以1-6位键和的糖基或非还原末端基(1-6 )经高碘酸氧化，消耗二分子高碘 酸，同时释放一分子甲酸；Smith降解后产生甘油。叩. OHOHOCHO+CH2OH O KBH务CH2OHOHC O.H+甘油+乙二醇OH
8、OTJHCOOH OHjOflJ KB?O.s OHCH 1 OH HOHjOCblrOHCHOHCHaOH本实验通过纸层析检测终产物中的甘油、赤藓醇和糖。【实验材料】0.1mol/L 醋酸。2mol/L 硫酸。硼氢化钾。纸层析试剂及器材：除显色剂外，同实验二。硝酸银显色剂：A: 16%硝酸银水溶液：丙酮为1:9(V/V)。B: 1%NaOH 乙醇溶液(W/V)。C： 6mol/L氢氧化铵。【实验操作】1. 还原和水解 高碘酸氧化后经乙二醇处理的溶液对流水透析48小时，蒸馏水透析24小时， 于40C以下减压浓缩至10ml左右，加入70mg硼氢化钾于室温、暗处搅拌18小时24小时以还原多糖醛。用0.1 mol/L醋酸中和至pH67，对流水透析 48小时，蒸馏水透析24小时，减压蒸干，加1 mol/L硫酸2ml ,封管，100C 水解8小时，用碳酸钡粉末中和，定量滤纸过滤，滤液减压浓缩后，通过纸层析 方法检测。2. 纸层析操作详见实验2（单糖组成分析）。展层后，将滤纸取出，自然干燥，喷上试剂A，自然干燥，将滤纸浸入试剂B中，待斑点显出后，再浸入试剂C中以洗去 滤纸上的氧化银，然后用水冲洗1小时左右，风干。以正丁醇：乙酸：水=4:l: 5为展层剂时，甘油的Rf为：0.48，赤藓醇的Rf为：0.35。
