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1、蛋白质含量测定主要有五种方法，分别是凯式定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、 酚试剂法和考马斯亮蓝法。这五种方法各有特点，优缺点明确。凯氏定氮法蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分 解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离， 用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数， 即得蛋白质含量。因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质 称为粗蛋白。优点：重现性好，是目前分析有机化合物含氮量常用的方法 ,是一种蛋白质 测定的经典方法, ,测试结果准确。缺点：操作比较繁复，费时,试剂消耗量大。且此法测定的蛋白质含
2、量实际 上包括了核酸，生物碱，含氮类脂，卟啉，含氮色素等非蛋白质含氮化合物。 双缩脲定氮法双缩脲(NH3CONHCONH3 )是两个分子脲经180工左右加热，放出一个 分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与 CuSO4 形成紫色络合物，称 为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原 子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓 度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测 定范围为110mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液 和某些氨基酸等。优点：较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近
3、，以及干扰物质少。主 要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋 白质测定。缺点：不太灵敏；不同蛋白质显色相似。紫外吸收定氮法双缩脲法是传统的分光光度法测定蛋白质的方法,当含有两个或者两个以上 肽键的物质和碱性的硫酸铜反应时,形成紫色的络合物,这个颜色产物是肽键中的 氮原子和铜离子配价结合的结果。蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残 基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。形成颜色产物的量取 决于蛋白质的浓度。实际测定时,必须预先用标准蛋白质溶液制作一个标准校正 曲线,通常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白质标准溶液。不同浓度的标准蛋白质溶 液加入双缩脲试剂
4、后，反应生成的颜色产物用紫外-可见分光光度计在540nm波 长下测定吸光度,以双缩脲试剂加缓冲或水作空白对照。然后将测得的值分别对 蛋白浓度(mg/ ml)作图，得标准曲线。未知蛋白样品用双缩脲试剂做同样处理， 根据测得吸光度值在标准曲线上直接查得未知蛋白质样品中得蛋白质浓度。优点：对各种蛋白质呈色基本相同;特异性和准确度好,精密度好;呈色稳定性 好,试剂单一,方法简便。快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。缺点：准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那 些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法 适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若
5、样品中含有嘌呤、嘧啶及 核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表， 再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收 是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。此外，进行紫外 吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因 pH 的改变而有变化，因此要注意溶液 的 pH 值，测定样品时的 pH 要与测定标准曲线的 pH 相一致。酚试剂法此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即 Folin 酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产 生深蓝色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物
6、。Folin酚试剂中的磷钼酸盐一磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基 还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白 的量成正比。优点：灵敏度高,比双缩脲法灵敏约100 倍。操作简单，不需要特殊仪器设 备。缺点：费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式， 且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰 Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲 液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%）， 硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%
7、），丙酮（0.5%）等 溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液， 只须加浓碳酸钠氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色 浅，则必须提高碳酸钠氢氧化钠溶液的浓度 12 倍。进行测定时，加 F olin 酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应 只在pH = 10的情况下发生，故当Folin 酚试剂加到碱性的铜一蛋白质溶液中 时，必须立即混匀，以便在磷钼酸磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发 生。考马斯亮蓝法考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收 峰的位置（九max），由465nm变为595n
8、m，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。 经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨 基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。优点：灵敏度高，据估计比 Lowry 法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达 1yg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物 有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比 Lowry 法要大的多。 测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。 由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小 时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定
9、性最好。因而完全不用 像Lowry法那样费时和严格地控制时间。干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、 Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰 此测定法。缺点：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此 Bradford 法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 Y球蛋白为标准蛋白质以减少这方面的偏差。仍有一些物质干扰此法的测定， 主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS ）和0.1N 的NaOH（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样。标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用 Beer 定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。应用范凯氏定氮法适用样品广泛是国家标准第一法 。适合于各种食品中蛋白质的测定以及各类动植物蛋白测定。适用于0.2 I.Omg氮，误差为2%双缩脲定氮法适用于1 20mg氮。紫外吸收定氮法适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。适用于50 100yg氮。可检测的最低蛋白质量达5yg。通常测定范围是20250昨。考马斯亮蓝法适用于15yg氮。生物15-3班 彭师韬 0
