质粒抽提的原理和方法

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1、质粒抽提所有的质粒抽提方法首先都要考虑如下几点：如何去除RNA ，如何将质粒与细菌基因组 DNA 分开，如何去除蛋白质及其它杂质。【如何去除 RNA】去除 RNA 相对比较简单，首先是使用 RNase 消化 （抽提中或者抽提后 ）。 经过 RNase 消化后， RNA 变得比较小了，其残留对酶切反应几乎没有影响。如 果要彻底去除残留得 RNA ，则需要更烦琐的操作。【如何将质粒与细菌基因组 DNA 分开】 基本上是采用两种办法：一是利用酶 /弱去污剂部分裂解细菌，在抽提时只让 质粒从细菌中释放出来，而不让基因组 DNA 从细菌中出来，从而将质粒和基因 组 DNA 分开；二是利用 NaOH/SD

2、S 完全裂解细菌，让质粒和细菌基因组 DNA 都从细菌中出来， 再利用质粒和基因组 DNA 在变性 /复性过程中的不同表现， 将 质粒与基因组 DNA 分开。【去除蛋白质及其它杂质】 基本上是与去除细菌基因组同时实现的。但是，依据不同的细菌，不同的培养 条件，以及操作时的精细程度等，杂质的残留量会不同。所以，通常需要使用苯酚 做更进一步的纯化。经过上面的处理， 沉淀下来的质粒基本上可以用于酶切了。 如果要用于更高级 的实验，如转染，则需要做进一步的纯化，如 CsCl 超离心。【实验前方法 /试剂的选择】 首选方法是碱裂解法。如果有问题，或者是大质粒 （15 kb） ，则用温和的方 法 SDS

3、裂解法。详细情况见 “ 分子克隆 ” 。试剂盒几乎都使用碱裂解法，所以都有 一个通病，抽提大质粒时效果不好。【关于碱裂解法】 质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高 等特点。关于碱裂解法的原理， 复旦大学生化与分子生物学实验室的网站有一篇专 论，大家可以去看一下。这是一篇美文，非常有趣。文中提到了一个与几乎所有能 查到的资料不同的观点，也是非常有启发的。当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的变性；不适合大质粒的抽提。 碱裂解法是很剧烈的方法，质粒在碱性条件下会变性，时间一长，这种变性就成为 不可逆的了 （电泳时在超螺旋前面一点点，如果有一条带，就是此变性的质粒。

4、）。所以，要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。（似乎可以做这么一个推理：在碱性条件下，质粒的两条链从一点或者几个点开始分开，随着时间的延长， 直到完全分开。理论上讲，完全分开的两条链要很快地配对复性，成功率肯定不可 能是 100% 的，而没有完全分开的两条链却完全可能100% 配对复性。 ） 碱裂解法不适合大质粒的抽提，原因也是因为该方法太剧烈，使超螺旋比例较低。文献推 荐的抽提大质粒的方法是温和得多的方法，缺点是得率要低一些。现在得问题是， 大质粒的拷贝数本来就低，如果抽提方法得率再不高的话，抽提起来就很费力了。 如果注意到在碱裂解法中， 超螺旋比例随着碱裂解时间的延长而降低， 随着

5、粘稠度 的增加而减低这个现象， 完全可以使用碱裂解法来抽提大质粒的： 增加试剂的使用 量，使加入 NaOH/SDS 液后，溶液在 1 分钟内就能变得很清澈；立即加入中和 试剂。这个实验我们没有做过，但 QIAGEN 抽提大质粒用的就是碱裂解法。【质粒抽提的 8 大窍门】1：摇菌时间 - 过夜培养是一个普遍接受的概念，而且适合大部分情况。如 果出现了问题，调整培养时间会有帮助： Nick 多，则增加培养时间；酶切出现问 题，则减少培养时间。2：起始菌体量 - 大家习惯说 “从多少 ml 菌液中抽提质粒 ”，但一定要养成每 次都观察菌体量的习惯， 因为质粒毕竟是在菌体中， 而且，抽提质粒所用的试剂

6、量， 都只与菌体量有关。3：菌体的彻底悬浮 - 如果没有彻底悬浮菌体，则残留的菌体团块在溶液 II 加入后，变成一个外围几乎彻底裂解，往里不完全裂解，中间没有裂解的团块。这 个团块在溶液 III 加入后，会有一部分蛋白质继续存在于溶液中， 成为蛋白质残留 的最大根源。4：使用相对过量的试剂 - 这是适合所有核酸抽提的建议。 试剂相对过量的好 处是：稳定性好，纯度高，操作更简单。如果认为这样不经济，就少用一点菌体。5：裂解时间 - 加入溶液 II 后，混匀，体系最好能立即变得清澈。体系如果 变得清澈了，马上加入溶液 III 中和。如果体系不马上变清澈， 下次少用一点菌液， 或者多用一点溶液。如今

7、的质粒设计得越来越复杂了，奇怪的现象也越来越多，而 所有的奇怪现象，多与裂解时间有关。6：中和的操作 - 在 1.5ml 离心管中加入溶液 III 后，先颠倒两次，使管底 朝上，用指头弹击管底数次，再颠倒混匀。效果非常好。7：中和后的离心去蛋白 - 一定要将蛋白质彻底离心下去。 如果发现离心后仍 然有蛋白质漂浮在液面， 继续离心的效果并不好；而将上清倒入另外一个离心管中， 再离心，效果要好许多。【降低 RNA 残留的方法】RNA 的去除，首先是使用 RNase 消化。在溶液 I 中加入高浓度的 RNase A (100ug/ml) ，或者用含 25ug RNase A/ml TE 溶解抽提好的

8、质粒，都可以降 低 RNA 残留，但都不能彻底去除。幸运的是， RNA 的残留并不影响酶切等最常 用的用途。如果想彻底去除 RNA 残留，可以用试剂盒，或者使用对 4 个碱基都 作用的 RNase 。【降低 gDNA 残留的方法】gDNA 的残留问题，必须在抽提过程中解决，否则，就只能用胶回收方法处 理了。 gDNA 越大，越难于复性，也就越容易被去除；所以，一定要尽可能不打 断 gDNA 。裂解体系越粘稠， gDNA 越容易被扯断；操作手法越重， gDNA 也越 容易被打断。温和操作，使用相对过剩的试剂，是降低 gDNA 残留的最好方法。【降低蛋白质残留的方法】蛋白质的去除，主要是靠不溶解的

9、 K-SDS-蛋白质复合物的形成。虽然将中和 后的体系置于 4C 一段时间，可以形成更多的该不溶复合物，从而使蛋白质残留 更少，但实践证明这样做并不是必须的，除非是大量抽提。只要加入溶液 I 后的 悬浮，加入溶液 II 后的裂解及加入溶液 III 后的中和是均匀彻底的，蛋白质的残 留就应该在可以满足实验要求的水平；而只有溶液的用量足够，甚至过剩，才能确 保裂解和中和是彻底的。当然，试剂盒及苯酚的使用，是可以更进一步降低蛋白质 的残留的。【降低质粒 Nick 的方法】细菌收获时间， 菌株的选择， 抽提操作的剧烈程度是影响 Nick 的三个主要因 素。细菌收获过早，质粒还在复制过程中， Nick

10、的比例较高；过晚，细菌开始死 亡，杂质会比较多。如果使用胞内酶含量很高的宿主菌，会出现较高比例的 Nick。 加入溶液II及加入溶液III的混匀操作，也可以导致一些 Nick，但影响不会比 前两者大。【降低变性超螺旋的方法】理论上，用碱裂解法抽提质粒，变性超螺旋的出现是不可避免的。之所以大家 没有非常在意， 一是因为它的存在似乎对酶反应没有任何影响， 二是因为它的含量 并不一定高到被用电泳观察到。抽提使用相对过剩的溶液，在加入溶液 II 后，体 系能在1分钟内变澄清，再快速加入溶液 III，这样基本上能将变性超螺旋的出 现控制在电泳看不见的水平。（变性超螺旋电泳时比正常超螺旋跑得快一点点。）【

11、关于质粒多聚体】QIAGEN 提供了一个没有进一步解释的观察：从有些宿主菌中抽提质粒 （pT Z19），电泳能发现很多条带；但使用单酶切后，仍然变成一条带，大小正好是线 性单质粒的大小。根据这一观察，可以推理如下：那些大的条带 （质粒多聚体 ）是由 完整的单质粒 “粘”在一起形成的，而不是我的一条链与你的一条链复性在一起；第 二，这种 “粘”只是部分的，否则酶切会有问题；第三，这种 “粘”是脆弱的，线性后 的刚性足以打破它。如果是这样，质粒多聚体的出现与质粒的结构及序列有关，可 以不管它（也管不了 ），因为它不影响酶切，或者说，即使质粒多聚体切不动，也不 会影响太大。总之，碰到这种情况，不要简

12、单地认为有问题，而是应该一步一步往 下做，但一定要做完一步，检测一次，看一看结果与预期的吻合程度。【提高得率的方法】利用氯霉素抑制染色体的复制， 而不抑制质粒的复制这一特点， 在低拷贝质粒 的培养过程中添加氯霉素可以大大提高得率。从质粒抽提谈起复旦大学生化与分子生物学实验室碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规 技术。可是我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀 学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想大概是因为分子克隆里面 只讲实验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。这是导致我的学生误入歧途的主要 原因。后来我发现其实是

13、整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至有很多“老师” 也是这个状态。这就不得不让人感到悲哀了。我想这恐怕和我们的文化有点关系。中国 人崇尚读书，“学而优则仕”的观念深入人心。经常听到的是父母对他们的独苗说，你只要 专心读好书就可以了。所以这读书的定义就是将教课书上的东西记住，考试的时候能拿 高分这就是现代科学没有在中国萌发的根本原因。如果中国文化在这一点上不发生 变化，那么科学是不能在中国真正扎根的，它只能蜕化成新的“八股学”。生命科学是实验 科学，它讲究动手。如果实验科学只要看看书就可以了，那我想问有哪位神仙看看书就 会骑自行车了？或者听听体育老师的讲解就会滑冰了？可是光动手不思考，不

14、就成了一 个工匠？一个合格的生命科学研究者，需要在这两方面完善自己。一个杰出的科学工作 者，是一个熟知科学原理并善于应用的“艺术家”。每个曾经用碱法抽提过质粒的同学，希 望你看本文后能有所思考，让中国的未来有希望。为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液 I：50 mM 葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液 II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液 III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH,因此 用适当浓度的和适当 pH 值的 Tris-Cl 溶液，是再

15、自然不过的了。那么50 mM 葡萄糖是 干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快 速沉积到管子的底部。因此，如果溶液 I 中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几 乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是 Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制 DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM的EDTA，无非就是 要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大 不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕 D

16、NA 会迅 速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I， 可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或 LB 培养基来悬浮菌体就可 以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。轮到溶液 II 了。这是用新鲜的0.4 N 的 NaOH 和 2的 SDS 等体积混合后使用的。 要新从浓NaOH稀释制备0.4 N的NaOH,无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的 CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS,所以才叫碱法 抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰 到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从 bilayer （双层膜）结构向 micelle （微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无 法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试