普通分子标记

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1、分子标记分子标记（Molecular Markers），是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础 的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。大多数分子标记为共显性，对隐 性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在 生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA 的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、 迅速。随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传 育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。理想的分子标记必须达以下几个要求：具有高的

2、多态性；共显性遗传，即利 用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型； 能明确辨别等位基因； 遍布整个 基因组； 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组； 选择中性 （即无基因多效性）；检测手段简单、快速（如实验程序易自动化）；开发成本 和使用成本尽量低廉； 在实验室内和实验室间重复性好（便于数据交换）。但是， 发现的任何一种分子标记均通过电泳分离不同的生物DNA分子，然后用经标记的特异 DNA探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示DNA的多态 性。 限制性片段长度多态性（Restrietion Fragment Length Polymorphism, RFLP

3、1974年Grodzieker等创立了限制性片段长度多态性（RFLP）技术，它是一种 以DNADNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP基本原理：利用特定的限制 性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段， 所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了 DNA分子上不同酶切位点的分布情 况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行 Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的 是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的 等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发

4、生 改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。RFLP的等位基因其有共显性特点。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到 的基因座位数为14个。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因 组DNA多态性的探针较为困难；另外，实验操作较繁锁，检测周期长，成本费 用也很高。自RFLP问世以来，已经在基因定位及分型、遗传连锁图谱的构建、 疾病的基因诊断等研究中仍得到了广泛的应用。 数目可变串联重复多态性(Variable Number of Tandem Repeats， VNTR 数目可变串联重复序列又称小卫星DNA（Minisatellite DNA），是一种重复DNA 小序列，为10到

5、几百核苷酸,拷贝数10 一 10001不等。VNTR基本原理与RFLP 大致相同，只是对限制性内切酶和DNA探针有特殊要求：限制性内切酶的酶 切位点必须不在重复序列中，以保证小卫星或微卫星序列的完整性。内切酶 在基因组的其他部位有较多酶切位点，则可使卫星序列所在片段含有较少无关 序列，通过电泳可充分显示不同长度重复序列片段的多态性。分子杂交所用 DNA探针核昔酸序列必须是小卫星序列或微卫星序列，通过分子杂交和放射自 显影后，就可一次性检测到众多小卫星或微卫星位点，得到个体特异性的DNA 指纹图谱。小卫星标记的多态信息含量较高，在17 一 19之间。缺点是数量有限，而且在 基因组上分布不均匀，这

6、就极大限制其在基因定位中的应用。VNTR也存在实验 操作繁琐、检测时间长、成本高的缺点。标记技术随机引物的PCR标记 所用引物的核苷酸序列是随机的，其扩增的DNA区域事先未知。随机引物PCR 扩增的DNA区段产生多态性的分子基础是模板DNA扩增区段上引物结合位点 的碱基序列的突变，不同来源的基因组在该区段上表现为扩增产物有无差异或 扩增片段大小的差异。随机引物PCR标记表现为显性或共显性。 随机扩增多态性 DNA （Random Amplified Polymorphism DNA， RAPD）RAPD技术是1990年由Wiliam和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA多态 性的方法。

7、基本原理：它是利用随机引物（一般为810bp）通过PCR反应非 定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片 段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所使用的引物各不相 同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基 因组在这些区域发生DNA片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结 合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态 性。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列 引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA 进行多态性检测，也可用于构

8、建基因组指纹图谱。与RFLP相比，RAPD具有以下优点：（1）技术简单，检测速度快；RAPD分析只 需少量DNA样品；不依赖于种属特异性和基因组结构，一套引物可用于不同 生物基因组分析；成本较低。但RAPD也存在一些缺点：（1） RAPD标记是一个 显性标记，不能鉴别杂合子和纯合子;存在共迁移问题，凝胶电泳只能分开 不同长度DNA片段，而不能分开那些分子量相同但碱基序列组成不同的DNA片 段；RAPD技术中影响因素很多，所以实验的稳定性和重复性差。 任意引物 PCR （Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction，APPCR）在 AP PCR 分析中

9、，所使用的引物较长（ 10 50 bp） ， PCR 反应分为两个阶 段，首先寡核苷酸引物在低严谨条件下与模板 DNA 退火，此时发生了一些合 成，以便稳定模板与引物之间相互作用。然后进行高严谨退火条件的循环，两 个位点间那些序列在低严谨度退火条件下发生的引物延伸可继续在高严谨条件 下扩增。采用变性聚丙烯酞胺凝胶电泳分析 PCR 产物，最终反应结果与 RAPD 类 似。只要设计的引物在低严谨退火条件下能减少引物产生人为产物，应用成对 组合的引物可以产生新的APPCR谱带，但引物配对组合使用时，得到的图谱 与单引物单独使用时产生的图谱之和很不相同，这样，50个引物能产生1250 种不同指纹图谱。

10、APPCR 方法不需预知序列资料，而且检测的基因组样本是任意的，还能够用 于检测近等基因系（或同类系）中的多态性。APPCR的缺点是每个新的多态 性都必须经纯化才能进一步使用。另外，此方法在杂合体中仅可辨别长度多态 性。 DNA 扩增指纹印迹（DNA Amplification Fingerprinting， DAF）DAF是一种改进的RAPD分析技术，与RAPD技术不同的是，DAF分析中所使用的 引物浓度更高，长度更短（一般为5 一 8 bp），因此它所提供的谱带信息比 RAPD大得多，如当使用5个核昔酸的引物时，引物和模板的组合大约可扩增出 10 一 100个DNA片段。PCR扩增产物是在

11、凝胶上进行分离，通过银染即可产生 非常复杂带型。特异引物的 PCR 标记特异引物的PCR标记所用引物是针对已知序列的DNA区段而设计的，具有特定 核苷酸序列（通常为1824 bp），可在常规PCR复性温度下进行扩增，对基 因组DNA的特定区域进行多态性分析。 序列标志位点（Sequence Tagged Sites， STS）STS是对以特定对引物序进行PCR特异扩增的一类分子标记的统称。通过设计 特定的引物，使其与基因组DNA序列中特定结合位点结合，从而可用来扩增基 因组中特定区域，分析其多态性。利用特异PCR技术的最大优点是它产生信息 非常可靠，而不像RFLP和RAPD那样存在某种模糊性。

12、简单重复序列(Simple Sequence Repeat, SSR)简单重复序(SSR)也称微卫星DNA，其串联重复的核心序列为1 一 6 bp,其中 最常见是双核苷酸重复，即(CA) n和(TG) n每个微卫星DNA的核心序列结构 相同，重复单位数目10 一 60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。 SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应 扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩 增出不同长度的 PCR 产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决 定基因型并计算等位基因频率。SSR具有以下一些优点：(l) 一般检

13、测到的是一个单一的多等位基因位点； 微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；所需DNA量少。显然，在 采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信 息。如不能直接从DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。 序列特异性扩增区(Sequence一characterized Amplified Region， SCARSCAR 标记是在 RAPD 技术基础上发展起来的。 SCAR 标记是将目标 RAPD 片段进 行克隆并对其末端测序，根据RAPD片段两端序列设计特异引物，对基因DNA 片段再进行PCR特异扩增，把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来。SCAR 标

14、记是显性遗传，待检DNA间的差异可直接通过有无扩增产物来显示。SCAR 标记方便、快捷、可靠，可以快速检测大量个体，结果稳定性好，重现性高。 单引物扩增反应(Single Primer Amplification Reaction， SPAR)SPAR技术是与RAPD技术相似的一种标记技术，SPAR也只用一个引物，但所用 的引物是在SSR的基础上设计的。这些引物能与SSR之间的间隔序列进行特异 性结合，然后通过PCR技术扩增SSR之间的DNA序列，凝胶电泳分离扩增产 物，分析其多态性。另外，还有一种与SPAR技术非常相似的标记技术，即 ISTR (Inverse Sequence一tagged

15、 Repeat)技术，ISTR 所用的引物是在反向 重复序列基础上设计的,PCR扩增的是反向重复序列之间的DWA序列。 DNA单链构象多态性 (Single Strand Conformation Polymorphism， SSCP)SSCP是指等长的单链DNA因核昔酸序列的差异而产生构象变异，在非变性聚丙 烯酞胺中的表现为电泳迁移率的差别。单链DNA构象分析对DNA序列的改变非 常敏感，常常一个碱基差别都能显示出来。在SSCP分析中，利用PCR技术定点 扩增基因组 DNA 中某一目的片段，将扩增产物进行变性处理，双链 DNA 分开成 单链，再用非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳分离，根据条带位置变化

16、来判断目的片 段中是否存在突变。SSCP结果判定是通过多个样品之间对比，观察条带之间位 置改变，从而显示出不同生物个体的DNA特异性，达到指纹分析目的。为了进 一步提高SSCP的检出率，可将SSCP分析与其它突变检测方法相结合。其中与 杂交双链分析(Heterocluplex analysis，Het)法结合可以大大提高检出率。 Het法是用探针与要检测的单链DNA或RNA进行杂交，含有一对碱基对错配的 杂交链可以和完全互补的杂交链在非变性PAG凝胶上通过电泳被分离开。对同 一靶序列分别进行SSCP和Het分析可以使点突变的检出率接近100%，而且实 验简便。 双脱氧化指纹法(Dideoxy Fingerprints， ddF)ddF是将双脱氧末端终止测序法与SSCP结合起来的分析技术，对由双脱氧末端 终止的长短不一的单链DNA进行SSC