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1、血红蛋白的提取与分离（第一课时）学习目标1、理解凝胶色谱法、电泳法的基本原理，了解缓冲液的组成及其作用；2、掌握血红蛋白的提取与分离的基本过程和方法。学习重点凝胶色谱法的原理和方法。学习难点：1、样品的预处理；2、色谱柱填料的处理和色谱柱的装填小组合作、自主探究【思考】蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。【基础知识】 凝胶色谱法（分配色谱法）：1、概念：根据被分离蛋白质的 ，利用具有网状结构的凝胶的分子筛选作用，来分离蛋白质的有效方法。2、原理：当不同的蛋白质通过
2、凝胶时，相对 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ，而 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速 ，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。3、具体过程：凝胶颗粒相对分子质量较小的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质（1）（2）（3）（4）（5）BA多孔板A. 的蛋白质由于 作用进入凝胶颗粒内部而被滞留； 的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在了里之间迅速通过。B.（1） 混合物上柱；（2）洗脱开始， 的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内； 的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外；（3） 的蛋白质被滞留； 的蛋白质被向下移动。（4） 不同的蛋白质分子完全分开；（5） 的蛋白质行程较短，已从 中
3、洗脱出来， 的蛋白质还在行进中。 缓冲溶液：1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。2、作用：能够抵制 的对溶液的 的影响，维持PH基本不变。3、缓冲溶液的配制通常由 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的 就可以制得 使用的缓冲液。思考：说出人体血液中缓冲对？ 思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）电泳：1、概念：指 发生迁移的过程。2、原理：
4、许多重要的生物大分子，如 等都具有 在 下，这些基团会带上 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其 移动。电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身 、 的不同使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分离。3、分类： 电泳 电泳。阴极阳极加入待分离的样品带电性质、分子大小和形状的不同，使分子迁移速度不同分子向阳极移动缓冲液琼脂胶溶液槽凝胶电泳原理示意图测定（ 蛋白质相对分子质量 ）通常用十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入 。SDS能使蛋白质发生完全变性。
5、由几条 肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是 。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于 。血红蛋白的提取与分离（第二课时）学习目标1、理解凝胶色谱法、电泳法的基本原理，了解缓冲液的组成及其作用；2、掌握血红蛋白的提取与分离的基本过程和方法。学习重点凝胶色谱法的原理和方法。学习难点：1、样品的预处理；2、色谱柱填料的处理和色谱柱的装填小组合作、自主探究 实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理粗分离纯化纯度鉴定1.样品处理 (1)红细胞
6、的洗涤目的：去除 方法： 离心，然后用胶头吸管吸出上层透明的 ，将下层 的红细胞液体倒入 再加入 质量分数为0.9的氯化钠溶液，缓慢搅拌10min,离心低速短时间离心。重复洗涤 次，直至上清液中已没有 ，表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。思考：洗涤次数为什么不能过少？离心速度和时间为什么不能过高和过长？(2)血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加 到 体积，再加40体积的 （溶解细胞膜） ，置于 上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）, 细胞破裂释放出血红蛋白.(3)分离血红蛋白溶液将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min ，试管中的
7、溶液分为4层:第1层（最上层）： 甲苯层第2层（中上层）： 的沉淀层， 色薄层固体第3层（中下层）： 的水溶液层， 的液体第4层（最下层）：其它杂质 的沉淀层(4)透析2.凝胶色谱制作1）凝胶色谱柱的制作取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。柱底部的制作：a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；b、在橡皮塞顶部切出锅底状的 ，在0.5mL的 头部切下 长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。c.剪尼龙网小圆片覆盖在 上，用 的尼龙纱将橡皮塞 包好，插到玻璃管一端。d、色谱柱下端用移液管头部做 ，连接一细的 ，并用螺旋夹控制尼龙管的 ，另一端放入收集 的收集器内柱顶部
8、的制作：插入安装了玻璃管的橡皮塞组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。2）凝胶色谱柱填料的处理（1）凝胶的选择： 。（2）方法： 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于 中充分溶胀后，配成 。（3）凝胶色谱柱的装填方法 固定：将色谱柱处置固定在支架上装填：将 一次性的缓慢倒入 内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。 洗涤平衡 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在 高的操作压下，用300mL的20mmoL/L的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分 12小时。思考：为了加速凝胶的膨胀，我们可以如何操作？凝胶的装填为什么要紧密、均匀？3）样品加入与洗脱（1）加样前：打开色谱柱
9、下端出口，使柱内凝胶面上的 缓慢下降到与 平齐，关闭出口。（2）加透析样品调整缓冲液面：与凝胶面平齐 加透析样品：用 将1mL 的样品加到色谱柱的 样品渗入凝胶床： 洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱 收集：待 接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每 收集一试管连续收集思考：在蛋白质分离过程中，色谱柱制作成功的表现是什么？思考：与其它蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。思考：你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（ ）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（ ）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（ ）。3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳判断（ ）的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度电泳方法步骤1)根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板 2）SDS聚丙烯酰胺凝胶制备3）样品处理： 4）把凝胶固定于电泳装置上5)加样：按顺序加样，加样量通常为1025 L。样品可
