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1、动物固体组织蛋白提取Protoc1、 前夜将磁珠及匀浆管洗净置入75%乙醇中浸泡。上午取出磁珠和匀浆管，自然晾干；也可放入烤箱中，速度较快。2、 裂解液配制：RIPA:PF=10:1,现配现用。(10ulRIPA+1MS）。置入4冰上。3、抽蛋白（应冰上进行）：a、适量组织（最佳放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。一般10ml管体系中加入：-8粒磁珠、100组织、1mlIPA10ulPMSF、 tbet Cktai。、匀浆。手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中,再将剩余的/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆,左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿
2、中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（68分钟),充足研碎，使组织匀浆化。 机器匀浆:用组织捣碎机000100rmn上下研磨制成0%组织匀浆,也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间1秒/次,间隙3秒，持续35次，在冰水中进行）,皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。超声粉碎:用超声粉碎机进行粉碎，可用oipp150型超声波发生器以振幅微米超声解决30秒使细胞破碎,也可用国产超声波发生仪，用安培，5秒次,间隙1秒反复35次。反复冻融:培养或者分离的细胞可以用以上的措施匀浆，也可以反复冻溶次左右(即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰,溶解,再结冰,再溶解，反复3次左右），但有部分酶
3、活力会受影响。c、将组织匀浆转入.ml的EP管中(ependf 管、离心管)。1mi C离心15mn。、离心后EP管中液体分三层,提取中间无色液相，移入新的P管中。可-8保存。4、蛋白浓度测定。a、配工作液：溶液:溶液B=：1(200ul：ul）。 需测试复孔。标本X,则需量=2*(X+）*200；B=2*（X11）*。LOSTWTc、复孔,取蛋白6ul加入0.6mlEP管，再加入54ulHO,混匀。即1倍稀释。d、取20-u 10倍稀释蛋白样本加入6孔板平底板内，再加入200ulAB工作液,混匀振荡后，37 inbte3min。注：应现加蛋白样本,再加工作液。由于每次加蛋白后需换tip，再加
4、入工作液即起反映,应缩短时间。e、酶标仪检测562n吸光度。Prormf、计算蛋白浓度。根据原则曲线,如 Y=.275-0.4 其中Y:蛋白浓度；:吸光度。 最后蛋白浓度为:10*Y（ug/l、mg/ml）g、蛋白样本放冻存。大多数蛋白样品可通过比色测定法定量。在典型的蛋白测定中，化学试剂加入到蛋白样品溶液里产生颜色变化,这一变化可由分光光度计或酶标仪检测，并与已知浓度的蛋白原则曲线作比较。博士德为人们提供两种蛋白测定手段,每种均有其独特的长处。如果样品数量较多，可以同步使用两种测定用酶标仪自动检测。当你选择一种蛋白测定措施时需要考虑两个因素：缓冲液的化学构成和检测的蛋白量。masie法(rd
5、d法)：原理：在酸性条件，蛋白质与考马斯染料25结合，颜色从棕色变为蓝色，在595nm处检测吸光值然后与原则曲线对比，即可计算出待测蛋白的浓度。BC法：原理:在碱性条件下，蛋白将Cu+还原为Cu，Cu+与BCA试剂形成紫色络合物，测定其在562nm处的吸取值，并与原则曲线对比,即可计算待测蛋白的浓度。现对这两种措施进行比较:一、实验材料：细胞总蛋白提取试剂盒（AR0103）M231BCA蛋白定量试剂盒(AR46)Comms改良增强型蛋白质定量试剂盒(014)二、操作环节：omassie法：1将BSA冻干原则品(10mg/支)用生理盐水或PBS稀释成ugml，100 ugml,500 ug/m,
6、20 ug/ml,125g/ml,625u/ml,32 ug/m,15625 ug/ml八个浓度的蛋白原则溶液。2M31用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。3.各取2u蛋白原则品和待测M23样品至相应标记的微孔板中。4滴加20ul考马斯增强型试剂（溶液A)至每孔混匀并充足震荡30S5.停止震荡,在室温孵育样品1min6.在酶标仪中测量95nm时的吸光值。7.绘制原则曲线，再用原则曲线判断出样品的蛋白浓度。BCA法：按0体积CA试剂A加入1倍体积BCA试剂B配备适量BA工作液，充足混匀。2.将BSA冻干原则品（10g支)用生理盐水或PBS稀释成ugml，10 ug/,500 g/ml,250 ugm
7、l,15 u/，6.ug/ml,1. u/l,15.65 u/ml八个浓度的蛋白原则溶液。3.M2用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。.各取0l蛋白原则品和待测231样品至相应标记的微孔板中。.滴加200ulCA工作液至每孔混匀并充足震荡S6.停止震荡,在3度孵育样品30min7.在酶标仪中测量562n时的吸光值。.绘制原则曲线,再用原则曲线判断出样品的蛋白浓度。三、实验成果 12346Commse法吸光值0.530.5220.30.220.10.01001C法吸光值0812.44.257014.0030.1其中到8为uml,1000,00,50，5,62.5，1.2,562的原则浓度的B蛋白,9
8、为空白孔,样品1为8倍稀释M231总蛋白,样品2为32倍稀释M231总蛋白Cmmasie法：为了测试精确,应在试剂加入后的50in内测定光吸取，由于在这段时间内颜色是最稳定的。 由原则曲线可以算出样品原始浓度为14.4/mlmmassie法长处是:1.敏捷度高,据估计比Lowr法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1ug。这是由于蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数,因而光吸取值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。测定迅速、简便，只需加一种试剂。完毕一种样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大概只要2分钟即可完毕,其颜色可以在1小时内保持
9、稳定，且在分钟至2分钟之间,颜色的稳定性最佳。3干扰物质少。如干扰Loy法的、Na+、g2+离子、i缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、DTA等均不干扰此测定法。此法的缺陷是:1.由于多种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Badord法用于不同蛋白质测定期有较大的偏差，在制作原则曲线时一般选用g球蛋白为原则蛋白质,以减少这方面的偏差。2. 仍有某些物质干扰此法的测定,重要的干扰物质有：去污剂、TritonX-10、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.M的NH。（犹如01的酸干扰Low法同样)。3 原则曲线也有轻微的非线性,在0-1000ug/ml浓度范畴内有较好线性。因而不能用Ber定律进
10、行计算,而只能用原则曲线来测定未知蛋白质的浓度。BCA法:由原则曲线可以算出样品原始浓度为142mg/mBCA法特点: 1 敏捷度高，检测浓度下限达到5g/ml,最小检测蛋白量达到0.g，待测样品体积为10l 。2 测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响,可以兼容样品中高达5%的SDS,5%的Tton X-10,5%的een 20，60,0。 3. 在20gml浓度范畴内有良好的线性关系。 4. 检测不同蛋白质分子的变异系数远不不小于考马斯亮蓝法蛋白定量。 . 受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响：DTA不不小于10mM。T不不小于1mM巯基乙醇低于1mM法和Commasie法各有
11、优势,在不懂得蛋白样本缓冲液成分的状况下可以两种措施配合使用，以消除定量的误差。（aio munoprecipitato Assay）RIPA裂解液(RPALysis Buffer)是一种老式的细胞组织迅速裂解液。RPA裂解液裂解得到的蛋白样品可以用于常规的esrn、IP等。RIPA使用措施对于培养细胞样品:1.融解RIPA裂解液，混匀。取合适量的裂解液，在使用前数分钟内加入P,使PF的最后浓度为mM。2. 对于贴壁细胞:清除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍（如果血清中的蛋白没有干扰,可以不洗)。按照6孔板每孔加入250微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下,使裂解液和细胞充足
12、接触。一般裂解液接触细胞1-2秒后,细胞就会被裂解。对于悬浮细胞:离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照孔板每孔细胞加入50-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充足裂解细胞。充足裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多,必需分装成50-10万细胞管，然后再裂解。裂解液用量阐明：一般6孔板每孔细胞加入150微升裂解液已经足够,但如果细胞密度非常高可以合适加大裂解液的用量到20微升或20微升。对于组织样品：. 把组织剪切成细小的碎片。2.融解RIPA裂解液,混匀。取合适量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF,使PMS的最后浓度为1mM。3. 按照每20毫克组织加入150-50微
13、升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充足可以合适添加更多的裂解液,如果需要高浓度的蛋白样品，可以合适减少裂解液的用量。)4. 用玻璃匀浆器匀浆，直至充足裂解。5.充足裂解后,1000-14000g离心分钟,取上清，即可进行后续的PAGE、Westrn和免疫沉淀等操作。. 如果组织样品自身非常细小,可以合适剪切后直接加入裂解液裂解,通过强烈ote使样品裂解充足。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的长处是比较以便，不必使用匀浆器，缺陷是不如使用匀浆器那样裂解得比较充足。注:RIPA裂解液的裂解产物中常常会浮现一小团透明胶状物,属正常现象。该透明胶状物为具有基因组DNA等的复合物。在不检测
14、和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的状况下,可以直接离心取上清用于后续实验;如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声解决打碎打散该透明胶状物,随后离心取上清用于后续实验。如果检测某些常用的转录因子，例如F、p5等时，一般不必进行超声解决,就可以检测到这些转录因子。多种IP的差别及用途产品名称Weern及I细胞裂解液IPA裂解液（强）RPA裂解液（中）RIPA裂解液(弱)NP0裂解液SDS裂解液有效裂解成分1% Triton X-1001 Trin 1, 1%doxychte, .1 SDS% N-4, .5%dehle, 1% SDS% NP-40， 0.25dexcholate P401SD裂解强度温和强中温和温和强对膜蛋白的提取一般较好较好一般一般较好对胞浆蛋白的提取较好较好较好较好较好较好对核蛋白的提取较好
