大肠杆菌感受态多种方法

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1、当前位置：生命经纬 实验技术 生物化学与分子生物学实验技术大肠杆菌感受态细胞的制备和转化BIOX.CN 2005-4-14 10:53:00 来源：生命经纬第一节概述在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中， 一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如 需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段， 它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的

2、受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化 酶的突变体(RIM ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一 些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl )等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性 的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Component cells)。进入受体细胞的DNA分 子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛 选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。目前常用 的感受态细胞制备方法有CaCl2

3、和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高， 但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用 时,可加入占总体积15%的无菌甘油于-70C保存(半年)，因此CaCl2法为使用更广泛。为了提高转化效率，实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于4C的培养菌，最好从一70。或-20。 甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为 好，可通过监测培养液的0D600来控制DH5a菌株的0D600为0.5时，细胞密度在5X107个/ml 左右(不同的菌株

4、情况有所不同)，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。2. 质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外 源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降 低。1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过 感受态细胞体积的5%。3. 试剂的质量：所用的试剂，如CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或AR.)，并用超纯水配制， 最好分装保存于干燥的冷暗处。4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管， tip头等最好

5、是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或 杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。本实验以E.coliDH5a菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态,然后与pBS质粒共 保温，实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr），可通过Amp抗性来筛选转化子。 如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞 （转化子）肯定已导入7pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一 步鉴定。本实验以E.coliDH5a菌株为受体细胞，

6、并用CaCl2处理，使其处于感受态,然后与pBS质粒共 保温，实现转化。由于p BS质粒带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr），可通过Amp抗性来筛选转化子。 如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞 （转化子）肯定已导入7pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一 步鉴定。第二节材料、设备及试剂一. 材料E. coli DH5a菌株：R,M,Amp； pBS质粒DNA:购买或实验室自制， eppendorf 管。二设备恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，无菌工作台，低温冰箱，恒温水浴 锅，制冰机，分光光度计,微量移液枪

7、。三.试剂1. LB固体和液体培养基：配方见第一章。2. Amp母液：配方见第一章。3. 含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60C左右, 加入Amp储存液，使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。4. 麦康凯培养基（Maconkey Agar）:取52g麦康凯琼脂，加蒸馏水1000ml,微火煮沸 至完全溶解，高压灭菌，待冷至60C左右加入Amp储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇 匀后涂板。5.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2（无水,分析纯），溶于50ml重蒸水中， 定容至100ml,高压灭菌。6.含15%甘油的0.05mol/L C

8、aCl2:称取0.28g CaCl2（无水,分析纯），溶于50ml 重蒸水中，加入15ml甘油，定容至100ml,高压灭菌。第三节操作步骤一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5a单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基 中，37C下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比 例接种于100ml LB液体培养基中，37C振荡培养2-3小时至0D600 =0.5左右。二、感受态细胞的制备（CaCl2法）1、将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟,然后于4C下3000g离心10分钟。2、弃去上清，用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10

9、ml轻轻悬浮细胞，冰上放置 15-30分钟后,4C下3000g离心10分钟。3、弃去上清，加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细 胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。4、感受态细胞分装成200u l的小份，贮存于-70C可保存半年。三、转化1、从-70C冰箱中取200ul感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰 上。2、加入pBS质粒DNA溶液（含量不超过50ng,体积不超过10ul），轻轻摇匀，冰 上放置30分钟后。3、42C水浴中热击90秒或37C水浴5分钟，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。4、向管中加入1ml LB液体培养基（不含Amp）,

10、混匀后37C振荡培养1小时，使细 菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr ）。5、将上述菌液摇匀后取100ul涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小 时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37C培养16-24小时。同时做两个对照：对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常 情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5ul菌液涂布于 不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。四、计算转化率统计每个培养皿中的菌落数。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据

11、此皿中的菌落数可计算 出转化子总数和转化频率，公式如下：转化子总数=菌落数X稀释倍数X转化反应原液总体积/涂板菌液体积转化频率（转化子数/每mg质粒DNA）=转化子总数/质粒DNA加入量（mg） 感受态细胞总数=对照组2菌落数X稀释倍数X菌液总体积/涂板菌液体积 感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数注意本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。但 它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才 能得到单菌落平板，而有的转化效率低，涂板时必须将菌液浓缩（如离心），才能较准确 的计算转化率。思考题1. 制备感受态细胞的原理是什么？2.

12、 如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释 这种现象？用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞BIOX.CN 2005-4-15 0:20:00 来源：丁香园下面的简单方案是Clhen等（1972）所用方法的变通方案，常用于成批制备感受态细菌，这 些细菌可使每微克螺旋质粒DNA产生5x106-2x107个转化菌落，这样的转化效率足以满足所有 在质粒中进行的常规克隆的需要。该方法完全适用于大多数大肠杆菌菌株，并且比方案I快速， 重复性更好。该法制备的感受态细胞可贮存于-70C，但保存时间过长会使转化效率在一定程度上 受到影响。1）从于37C培养16-20小时的新鲜平板中挑取

13、一个单菌落（直径2 3mm），转到一个含有100ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37C剧烈振摇培养约3小时（旋转摇床，300转/分）。为得到 有效转化，活细胞数不应超过108细胞ml，可每隔20-30分种测量OD600值来监测培养物的生长 情况。在菌株与菌株之间，0D600值和每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过 测量特定大肠杆菌菌株的生长增减物在生长周期的不同时相的0D600值，并将各黧度的增减物 铺于无抗生素的LB琼脂平皿以计算每一时相的活细胞数，从而使分光光度读数得到标化。2）在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管（Falcon 2

14、070） 中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0C。切记：下述所有步骤均需无菌操作。3）于4C用Sorvall GS3转头（或与其相当的转头）以4000转/分离心10分钟，以回收细胞。4）倒出培养液，将管倒置1分钏以使最后残留的痕量培养液流尽。5）以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。我们发现将1 mol/L CaCl2 贮存液用纯水（Mille-Q级或与其相当的级别）配制以10ml小份贮存于-20C煞是方便。制备 感受态细胞时，取一小份融化，用纯水稀释至100mlk，用Nalgene滤器（0.45um孔径）过滤除 菌，然后骤冷到0C即可。对于大多数大肠

15、肝菌菌株（除MC1061外），在这一步采用TFB （见 表1.3）代替氯化钙可得到相同的或更好的结果。6）于4C以4000转/分离心10分钟，以回收细胞。7）倒出培养液，将管倒置1分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。8）每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2或TFB，见表1.3和步骤5）注 重悬每份细胞沉淀。此时，可将细胞分成小份，放于-70C冻存有关讨论请参见53页本节（二） 步骤11）b.c）。在这些条件下，尽管长期保存后转化效率会稍有下降，但细胞仍可保持处于感受 态。Dagert和Ehrlich（1979）曾表明细胞可以于4C在CaCl2溶液中保存24-48小时

16、，在贮存的 最初12-24小时内，转化效率增加3 5倍，然后降低到初始水平。9）用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200 u l转移到无菌的微量离心管中，每管加 DNA（体积8i0pl,DNA850ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。10）将管放到预加温到42C的循环水浴中放好的试管回上，恰恰放置90秒，不要摇动试管。11）快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1 2分钟。12）每管加800 U1SOC培养基（见附录A）。用水溶将培养基加温至37C，然后将管转移到 37C摇床上，温育45分钟细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。如果要求更高的 转化效率，在复苏期中，应温和地摇动细胞（转