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1、人类Y染色体SRY基因的鉴定作者:日期:、背景介绍SRY基因又称为雄性的性别决定基因，指Y染色体上具体决定生物雄性性别的 基因片段。人的SRY基因位于丫p11.3，只含有一个外显子，没有内含子，转录单 位长约1.1kb，编码一个204氨基酸的蛋白质。由于SRY蛋白含有一典型的DNA结合结构域：高泳动类非组蛋白(high mobility group，HMG)盒基序，类似于已知的转录因子，所以推测SRY编码一个 转录因子。SRY的HMG域以一种序列特异的方式与DNA相结合，在双螺旋结构中引 入一个尖锐的转折。有证据显示，性反转病人HMG域中的突变可分为两类：影响 DNA结合和影响DNA弯曲的，提
2、示这两种性质对于SRY蛋白行使转录调节功能来说 都很重要。已发现HMG域在体外能以高亲和力与钙调素(Calmodulin，CaM)相结 合。这一现象的功能意义不明，但提示SRY的活性可能受另一个层次的调控。SRY在成年小鼠生殖细胞中表达为一环状转录物，在发育中的小鼠性腺里则转 录为一个长4.8kb的RNA，所用的启动子也与成年鼠不同。SRY于大约交配后 10.5-11天(days postcoitum，dpc)的生殖嵴中专一开启，正好是两性间出现可 观察的形态学差异之前；于12.5dpc左右关闭。因此SRY的功能是启动睾丸分化而 不是维持睾丸存在。Lovell-Badge认为SRY起一种感受态
3、因子的作用。因为有些 小鼠虽然有SRY的表达，但未能把细胞定型到雄性途径。相反在完全没有SRY的情 况下，有时卵巢组织也能逆转成睾丸。目前，已经在所有哺乳动物包括有袋目动物中发现了 SRY基因。在不同的物种 中，SRY蛋白的HMG域高度保守，但是即使是在有亲缘关系的物种之间，SRY蛋白 的其余部分也并不同源。还不肯定这是否意味着HMG域是SRY蛋白中唯一功能上重 要的区域。Y染色体上95%是男性特异区域，里面含和男性有关的基因，通共有156个转 录单位，有78个编码蛋白质的基因，最后是27个完全不同的蛋白。约10%的基因 是近几百万年才从X染色体移到Y染色体上来，还有20%是更早以前来自于X染
4、色 体，其余是一些回文结构。象中文诗词玩文字游戏一样,DNA的回文也是顺过来和 倒过去读都是一样的序列。佩基等发现丫染色体的男性特异区域重复有回文结构, 这是以前科学家们没有预计到的。在技术上，重复结构给测序带来很多困难。在科 学上，这些重复回文结构的发现对于理解Y染色体有很大帮助。有研究发现：丫染色体有许多重复回文结构的序列，并且这些重复的回文结构 有DNA重组能力(具体说叫“基因转换”)，丫染色体自己的一段和另外一段之间进 行重组，这样靠自我重组来获得活力。这是第一次知道丫染色体在其男性特异区域 有重组，以前这段DNA被称为非重组区域，现在也就改名叫男性特异区域了。这个 自我重组能力是进化
5、过程中丫用来自救的重要机制。大规模的基因转换在每一代男 孩出现，而且猜想常染色体和X染色体上说不定也有些区域有基因转换，给其它染 色体也可能增加“活力”。二、实验原理本实验将通过PCR扩增技术, 对SRY基因进行扩增，以此验证 性别。聚合酶链反应（Polymerase Cha in Reaction , PCR）是体外核 酸扩增技术。它具有特异、敏感、 产率高、快速、简便、重复性好、 易自动化等突出优点，能在一个 试管内将所要研究的目的基因或 某一 DNA片段于数小时内扩增至 十万乃至百万倍，使肉眼能直接 观察和判断。PCR由变性一退火（复性）一 延伸三个基本反应步骤构成。模 板DNA的变性：
6、模板DNA经加热至94C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备; 模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至4060C 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结 合物在DNA聚合酶的作用下，于72C左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板， 按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重 复循环变性一退火一延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”而且这种新 链又可成为下次循环的模板。每完成一循环需24分钟，23小时就能将待
7、扩 目的基因扩增放大几百万倍。琼脂糖凝胶电泳是利用不同分子量的DNA在琼脂糖凝胶电厂中电泳速度不同 而分离DNA片段的方法，琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要依据它们的相对分 子质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳 动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在 电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应, 即DNA分子本身的大小和构型。在凝胶中，DNA片段（小于20kb）迁移距离（迁移 率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的 移动距离进行比较，便可测出未知片段的大
8、小。此法以观测，灵敏度较高，而且 DNA可以切胶回收，是现在PCR反应后最常用的实验方法，唯一美中不足的是所需 要的染剂EB是一种剧毒物质，会引起多种病症的产生，因而在使用中一定需要多 加注意。三、实验目的1、了解性别决定的SRY分子机制2、掌握口腔上皮细胞和毛囊细胞基因组DNA提取的方法;3、掌握PCR反应的基本原理；4、掌握琼脂糖凝胶电泳法对于条带的鉴定。四、实验材料、试剂及仪器1、实验材料男性的口腔上皮细胞及头发毛囊细胞、女性的口腔上皮细胞及头发毛囊细胞2、实验试剂DNA 提取液、0.2mol/L NaOH 溶液、0.04mol/L HCl 溶液、1OXPCR 缓冲液、 25mmol/L
9、 MgCQ 2.5mmol/L dNTP、10umol/L SRY 引物 1、10umol/L SRY 引物2、5 U/l Taq酶溶液、无菌水、琼脂糖、缓冲液3、仪器PCR仪、电泳仪、离心机、紫外投影机五、实验步骤1、口腔粘膜上皮细胞或毛发样品DNA的制备(1) 男生口腔粘膜上皮细胞或毛发数根，女生口腔粘膜上皮细胞或毛发数根作为对照。(2) 剪下带毛囊的发根部分，放入一个200ul PCR管，加20,的0.2mol/L NaOH溶 液，75C温育30min (在有热盖的PCR仪中反应，以避免水分蒸发)。(3) 加入 100 J 的 0.04 mol/L HCl 中和。(4) 12000 r/
10、mi n离心5mi n去除未溶解的沉淀物，上清转入1个新管，DNA就在水溶 液中。2、PCR反应(1) 扩增人的SRY基因，所用引物为：SRY1: 5 -TGG GAC TGG TGA CAA TTG TC-3SRY2： 5 -GAG TAC AGG TGT GCA GCT CT-3(2) 每个样品反应体系为251。首先将下列成分预混，再分装为4个管：试剂名称试剂量PCR缓冲液10.0 ulMgCl2 (25mM)8.0 uldNTP (2.5mM)8.0 ulSRT 引物 1 (10uM)4.0 ulSRT 引物 2 (10uM)4.0 ulTaq酶2.0 ul灭菌水40 ul分装到4只0.
11、2 ml PCR管中(19|11/管)；其中两管分别加入6丨男生口腔上皮细胞和头发毛囊细胞DNA，另两管加入6丨女生 口腔上皮细胞和头发毛囊细胞DNA。反应体系配好后，就可以放入PCR仪中扩增，扩增程序如下:循环35次(3) PCR反应条件为:94# C3min94 C130s50 C30s72 C130s72 C5min10COO3、电泳检测制备1%的琼脂糖凝胶，取15, PCR产物，力加 3ul的loading buffer，混 匀，点样，同时点DNA分子量标记，在5V/cm的电压下电泳，电泳结束后用荧光 染料溴乙锭(EB)染色，紫外光下观察DNA条带，用凝胶成像系统输出照片；并进行 有关
12、的数据分析。六、实验结果及分析OO全班共跑了两块胶，可以看到上方的胶没有跑出来，连marker都没有跑出来 第二块儿胶由图可知三号和第七号样品出现条带(经验证，分别为徐霖和吴宏宇，都为 男生)，一号和五号也为男生但却没有带，可以看到，四号和六号为女生也是没有带的。 图中SRY基因大小在300bp左右，与DNA Marker对照可以看见很浅的条带，位于白色 圈内。七、思考与讨论1、上方的胶没有跑出带，原因较复杂，可能是由于PCR产物出现的问题，也可能是由于Marker点错了，也有可能是胶的问题2、对于下方的胶中，男生的SRY基因没有跑出来，在与老师交流过程中，我们得到多 种可能的原因：（1）加入Taq酶时没有混匀，就进入了 PCR仪，导致没有进行有效扩增（2）在提取DNA时，含量太少，导致没有模板，无法进行PCR扩增（3）时间较长，Taq酶在经过各个班级用过之后失活（4）据说冰箱停电过一段时间，很可能导致引物出现裂解，或者酶失活3、化胶的时候一定要让胶完全溶解，否则对于跑胶不利
