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1、动物分子病原学复习思考题一、举例阐述动物病原菌基因组学研究的意义。二、举例阐述病毒基因组学研究涉及的工作及其科学意义。三、以你熟悉的一种动物细菌为例，阐述开展其致病性分子机制研究的思路。四、与细菌耐药性相关的分子机制有哪些？五、以你熟悉的一种动物病毒为例，阐述运用你所知的分子生物学技术开展其相关分子生物学研究工作的思路。动物分子病原学复习思考题1. 一举例阐述动物病原菌基因组学研究的意义细菌基因组学研究的意义重要致病与毒力基因的发现与研究例如，HPI毒力岛最早发现于耶尔森菌属，通过对大肠杆菌基因组的分析，他也具有HPI毒力岛基因，是大肠杆菌的主要致病因子。1) 寻找灵敏及特异的病原分子标记一一
2、发现细菌的特异DNA序列，提高临床诊断的效率和准确性。分析多种病原菌的基因组序列差异，找到某一病原菌特有的基因序列，设计探针建立特异性诊断方法。2) 促进新药的发现和疫苗的发展识别和筛选药物靶位微生物基因上的药物靶位(靶基因)一般是一些毒力相关基因、微生物生存必需基因、种特异性基因、某些酶基因和膜转运蛋白基因等。3) 提高人类对病原菌相关基因功能的认识通过基因组测序后，我们又发现了许多之前没有认识到的基因及其功能。例如，。4) 细菌基因组的研究为生命科学开辟了新的研究领域生物信息学、比较基因组学等例如，发现一个新病原菌或新的变异菌株，可以通过BLAST生物信息学工具，在GenBank中确定他的
3、生物学分类地位。二举例阐述病毒基因组学研究涉及的工作及其科学意义。1.病毒基因组学研究的意义1）测定与鉴定未知基因序列2）确定重组DNA勺方向与结构3）对突变（变异）进行定位和鉴定4）病毒勺利用5）基因勺功能6）分子流行病学研究2.涉及工作1）基因组核苷酸一级结构分析比如在研究PCV勺过程中，由于其基因组比较小，只有170Ont左右，一般在对其研究之前首先对其基因组测序，为进一步分析基因组功能奠定基础。2）基因组结构分析分析基因勺开放读框（ORF）以核苷酸顺序推测相应蛋白质勺氨基酸顺序及二级结构、表位预测分析结构蛋白基因与非结构蛋白基因3）序列相似性比较例如，MDV最初发现时，单独划为一科，但
4、是通过对其基因组全长序列测定后发现，其基因组勺结构排列与简单疱疹病毒的基因组结构排列相同，UL和US区均有倒置重复序列，所以MDV更接近a-疱疹病毒。4）毒株间勺差异与变异情况，病毒基因型勺分析比如流感病毒它的H/抗原如果它的两个碱性氨基酸K噤着,前面第二个氨基酸如果还是碱性氨基酸那么它就是强毒株。5）遗传进化、演化规律对不同来源的PRRS进行全基因组测序，构建进化树，分析各毒株的亲缘关系。6）分子流行病学研究对PRRS病毒测序，看各地流行的毒株有什么不同，确定流行的毒株。选择同毒株的疫苗进行免疫预防。三以你熟悉的一种动物细菌为例，阐述开展其致病性分子机制研究的思路。细菌致病性的分子机制以大肠
5、杆菌为例阐述研究其致病性分子机制的思路：1、先研究大肠杆菌与宿主细胞黏附的分子基础病原性大肠杆菌具有多种毒力因子，引起不同的病理过程，它具有定植因子又称菌毛、黏附素或F抗原，可与黏膜表面细胞的特异性相结合而定植于黏膜，这是大肠杆菌引起的大多数疾病的先决条件。在引起动物腹泻的ETE中已发现的定植因子有F4、F3、F8F41。菌毛可与宿主细胞的受体分子特异性结合，特别是与细胞表面的多糖侧链结合。宿主细胞膜上的整合素是细菌侵袭素等的受体，与细菌侵入细胞密切相关整合素广泛分布于上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞及T细胞等细胞的一种跨膜蛋白。大肠杆菌是胞外菌主要研究它的一些致病因子：2、内毒素：大肠杆菌外膜
6、中含有脂多糖，当菌体崩解时被释放出来，其中的类脂A成分具有内毒素的生物学功能,是一种毒力因子，在败血症中其作用尤为明显。外毒素：大肠杆菌可产生外毒素，有不耐热肠毒素（LT）和耐热肠毒素（ST。LT可激活肠毛细血管上皮细胞的腺苷酸环化酶。使肠黏膜细胞分泌亢进，发生腹泻和脱水；ST可激活回肠上皮细胞刷状缘绒毛上的颗粒性鸟苷环化酶，增加cGM产生，同样引起分泌性腹泻。大肠杆菌素：从动物的全身性侵入性疾病中分离的许多大肠杆菌，具有产生大肠杆菌素V的质粒。细胞毒素：又称志贺样毒素（SLT。与引发人出血性肠炎有关，而SLT-2则能使猪产生水肿病的临诊和病理特征。细菌致病基因的鉴定方法：体外鉴定技术克隆筛选
7、法将有致病力表现型的相关基因转入异源细菌E.coli，在体外鉴定新的致病基因制备基因文库，然后将基因文库中的DNAt段装在载体（如质粒、噬菌体或黏粒）中，转化E.coli进行扩增，再用与致病有关的蛋白质制成的抗体或探针或抗体以筛选基因文库体内表达技术体内表达技术（Invivoexpressiontechnology，IVET），用于寻找致病基因的新方法以动物作为一种选择培养基，让动物自己筛选出与致病有关的基因，即ivi基因（invivoinducedgenes）Ivi基因仅在体内诱导表达，在体外并不表达4、与细菌耐药性相关的分子机制有哪些？细菌的耐药性1细菌耐药性的特点：耐药性形成的速度越来越
8、快；耐药谱越来越广；耐药性传播的速度越来越快；耐药强度越来越高公共卫生意义愈益重要2细菌耐药机制2.1耐药性的生化机制：药物作用位点发生改变干扰抗菌药物的输送过程抗菌药物的灭活或钝化B-内酰胺酶水解B-内酰胺类抗生素（青霉素酶、头孢菌素酶）酰胺酶使青霉素的酰胺键断裂氯酶素转乙酰基酶一一以辅酶A为辅酶，先使氯酶素3位上的0!基乙酰化，接种又将1位上的0F基乙酰化，形成无活性的1，3-二乙酰氧基氯酶素氨基糖苷类抗生素的钝化酶磷酸转移酶、腺苷转移酶及乙酰转移酶，这些酶作用于各种氨基糖苷类抗生素，使其失去活性细胞渗透性的改变旁路代谢细菌的外输泵2.2耐药性的遗传机制细菌的耐药性可遗传分别是由耐药性质粒
9、（R质粒）和染色体所介导的基因的改变耐药基因的掺入5、以你熟悉的一种动物病毒为例，阐述运用你所知的分子生物学技术开展其相关分子生物学研究工作的思路。FMDV的分子生物学研究1利用RT-PCR进行病原的诊断根据病毒基因组的保守序列设计引物，用于检测临床症状明显的猪群。从发病猪组织或血清中提取DNA或RNA（RNA需反转录成cDNA），以此做为模板扩增特异性的基因片段，从而确定病原。3. 多重RT-PCR,duplexRT-PC进行鉴别诊断与猪流行性腹泻，猪轮状病毒，猪的呼吸道冠状病毒等的鉴别2.realtime-PCR进行PCR产物的定量原理：通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进
10、行标记跟踪，实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量实时在线监控：对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期降低反应的非特异性：使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提高了PCR反应的特异性增加定量的精确性：全程监控，准确的算法进行定量结果分析更加快捷方便，无需跑胶RNA印迹技术(NorthernBlot)原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同SouthernBlot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测RNA琼脂糖电泳印迹转移预杂交杂交(变性探针)洗膜放射自显影或显色斑点印迹(dotblotting)原位杂交(insituhybridization)：病毒抗原在组织细胞及亚细胞水平的定位RNAF扰技术4. 长链dsRNA被切割成2025nt小干扰RNA(siRNA)siRNA与RNA诱导沉默复合物(RISC)结合，识别目的mRNAmRN与siRNA的反义链结合，置换出正义链；双链mRN被相关酶切割产生siRNA，后者与RISC结合，继续反复切割mRNA反向遗传操作技术
