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1、第二章发酵液预处理与固液分离发酵液预处理的目的：改变滤液的性质；除去部分可溶性杂质；尽可能使产物转入便 于后处理的一相中（多数是液相）一一以利于后继各工序的顺利进行发酵液预处理的主要方法： 加热法；调节pH值；凝聚和絮凝；使用惰性助滤剂；加入反应剂 凝聚：指在凝聚剂作用下，胶体脱稳并使粒子互相聚集成1mm大小块状聚集体的过程。 絮凝：使用絮凝剂将胶体粒子交联成网，形成较大（10mm大小）的絮凝团的过程，其中 絮凝剂主要起桥架作用。絮凝作用（桥架作用）：絮凝剂通过静电引力、范德华力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的 表面。当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架联接时， 就
2、形成了较大的絮团，这就是絮凝作用。铁离子的去除:加入黄血盐，可与铁离子形成普鲁士蓝沉淀而除去。固液分离方法:在发酵液或生物培养液的分离过程中，当前用得较多的还是过滤和离心两 大方法。第三章细胞的破碎与分离细胞破碎率的测定方法：（1）直接计数法；（2）间接计数法细胞破碎的主要方法：（1）机械法：珠磨法（固体剪切作用）、高压匀浆法（液体剪切作用）、超声法（液体剪 切作用）；（2）非机械法：酶溶法、化学法（用酸碱调节溶液的pH值；有机溶剂；表面活性 剂）、物理法（ 渗透压冲击法； 冻融法： 干燥法）第四章膜分离技术膜的水通量：在一定条件下，单位时间单位膜面积的水通量。 水通量：膜对纯水的通过量称水通
3、量。截留率（rejection coefficient）：是指对一定相对分子质量的物质，膜能截留的程度。截留分子量（molecular weightcutoff, MWCO） 般将在截留率为90%的最小被截留溶质分子 量定义为膜的截留分子量。PS:较好的膜应该有陡直的截留曲线。各种常用膜技术:微滤(Micro filtration, MF)、超滤(Ultra filtration, UF)、反渗透(Reverse Osmosis, RO)、纳滤(Nano filtration, NF)超滤原理：一般认为超滤是一种筛孔分离过程，在静压差为推动力的作用下，原料液中溶剂 和小溶质粒子从高压的料液侧透
4、过膜到低压侧，称为滤出液或透过液，而大粒子组分被膜所 阻拦，使它们在滤剩液中浓度增大。PS:超滤采用的是错流过滤的方式：超滤膜用截留分子量标志膜的型号；反渗透膜只能选择 性地透过溶剂：*浓差极化现象：在膜分离过程中，膜表面上溶质浓度高于主体溶质浓度的现象。进料浓差极化现象的原理：在超滤过程中，由于水透过膜，因而在膜表面的溶质浓度增高，形成 梯度，在浓度梯度的作用下，溶质与水以相反方向扩散，在达到平衡状态时，膜表面形成一 溶质浓度分布边界层，它对水的透过起着阻碍作用。如何降低浓差极化效应：通过改变诸如速度、压力、温度和料液浓度之类的操作参数，可 以降低浓差极化效应。反渗透基本原理:反渗透是利用反
5、渗透膜选择性地只能透过溶剂(通常是水)而截留离子 物质的性质，以膜两侧静压差为推动力，克服溶剂的渗透压，使溶剂通过反渗透膜而实 现对液体混合物进行分离的膜过程。PS:纳滤的分离性能介于超滤和反渗透之间过程应用对象微滤消毒、澄清收集细胞超滤大分子物质分离纳滤小分子物质分离反渗透小分子物质浓缩何谓膜污染，如何预防膜污染?膜污染：随着操作时间的增加，膜透过流速的迅速下降，溶质的截留率也明显下降，这一现 象被称为膜的污染。预防和控制膜污染的方法：预处理法；开发抗污染的膜；加大供给液的流速第五章萃取技术反胶束萃取:利用表面活性剂在有机溶剂中形成一种反胶束，从而对蛋白质进行萃取的技术。 临界胶束浓度(Cr
6、itical Micelle Concentration):当表面活性剂溶质在溶剂中的浓度达到一定 值时，才会产生聚集而生成胶束，该浓度称为表面活性剂的临界胶束浓度。反胶束：若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过CMC，便会在有机溶 剂内形成聚集体，这种聚集体称为反胶束。在反胶束中，表面活性剂的非极性基团在外与非极性的有机溶剂接触，而极性基团则排列 在内形成一个极性核(polar core)。此极性核具有溶解极性物质的能力。反胶束的极性核具有溶解极性物质的能力，极性核溶解水后,就形成“水池(water pool)。 当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质及其他亲
7、水物质能够通过 螯合作用进入此“水池”。由于周围水层和极性基团的保护，保持了蛋白质的天然构型， 不会造成失活。表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子。 AOT是用得最多的是阴离子表面活性剂，AOT可在有机溶剂异辛烷中形成反胶束。反胶束萃取原理：反胶束中极性头朝内，非极性尾朝外排列形成亲水内核，称为“水池”。 反胶束体系与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质及其他亲水物质能够通过螯合作用进入此“水 池”。由于周围水层和极性基团的保护，保持了蛋白质的天然构型，不会造成失活。反胶束萃取的优点：1) 有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性；2) 分离、浓缩可同时进行，过程简便
8、；3) 能解决蛋白质(如胞内酶)在非细胞环境中迅速失活的问题；4) 由于构成反胶束的表面活性剂往往具有细胞破壁功效，因而可直接从完整细胞中提取具有 活性的蛋白质和酶；5) 反胶束萃取技术的成本低，溶剂可反复使用等。双水相萃取：由于不同的溶质与两种聚合物的相溶性有所不同，其各自的分配系数也就有所 不同，因而可产生分离，此即为双水相萃取。常用双水相系统的类型： 聚合物/聚合物体系聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dextran) 聚合物/无机盐体系 PEG/硫酸盐 或 PEG/磷酸盐5.3彫响双水相分配的因素/聚合物的组成/盐类/溶质的物理化学性质 超临界流体（SCF）：指在临界温度（Tc）和临界压力（
9、Pc）以上的流体。高于临界温度和临界压 力而接近临界点的状态称为超临界状态。超临界流体萃取：是利用超临界流体即其温度和压力略超过或靠近临界温度（Tc）和临界 压力（pc），介于气体和液体之间的流体作为萃取剂，从固体或液体中萃取出某种高沸点 或热敏性成分，以到分离和提纯的目的。超临界流体萃取的基本原理：利用超临界流体的特殊性质，在高压条件下与待分离的固体或 液体混合物相接触，萃取出目标物。通过调节压力或温度改变溶剂密度从而改变溶剂萃取能 力。通过减压或升温的办法，降低超临界流体的密度，从而使萃取物与萃取剂分离。超临界流体萃取工艺：等温变压工艺；等压变温工艺；恒温恒压工艺第六章沉淀技术蛋白质沉淀的
10、方法：中性盐盐析法;有机溶剂法;等电点沉淀法;非离子型聚合物 沉淀法；其他沉淀方法中性盐盐析法原理： 蛋白质由于静电斥力的作用，分子间相互排斥，形成稳定的分散系。蛋白质周围有水化膜, 保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞。 在蛋白质溶液加入中性盐会使蛋白质脱水，并中和蛋白质所带的电荷，使颗粒间的相互排 斥力失去，而在布朗运动的互相碰撞下，蛋白质分子结合成聚集物而沉淀析出。最常用的中性盐（盐析剂）中最重要的是（NH4）2SO4分段盐析：不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同, 其水化膜厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节盐浓度，可以使不同的蛋白 质分别沉淀。
11、分段盐析的方法：改变离子强度；改变pH值和温度等电点：溶液的pH值高，蛋白质带负电，pH值低，蛋白质带正电，当溶液的pH值为 某一值时，蛋白质几乎不带电，即净电荷为零，此时的pH值称为等电点，常用pl表示。 等电点沉淀：调节体系PH值，使两性电解质的溶解度下降、析出的操作称为等电点沉淀。 等电点沉淀原理：蛋白质是两性电解质，当溶液PH值处于等电点时，分子表面静电荷为0， 双点层和水化膜结构被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。有机溶剂沉淀的原理： 降低水的介电常数（极性），使蛋白质分子水化程度降低，促进了蛋白质分子的聚集沉淀。 极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水，而使蛋白质分子沉
12、淀。有机溶剂选择依据： 能和水混溶；用量少； 生物物质活性的损失少； 最好无 毒性。第七章吸附与离子交换离子交换树脂的结构包含哪几部分？分为两部分： 不能移动的多价高分子基团，构成树脂的骨架。 可移动的离子，称为活性离子。阳离子交换剂：可解离出带正电的活性离子阴离子交换剂：可解离出带负电的活性离子离子交换的过程：1.离子交换;2.洗脱（解吸）；3.再生 第八章色谱分离技术色谱分离的三个单元部分：固定相，移动相，样品离子交换色谱原理：离子交换色谱的介质是在一种高分子的不溶性固体（载体）上引入具有活 性的离子交换基团，即阳离子交换基团或阴离子交换基团，这些基团与溶液中相同电荷的基 团进行交换反应。
13、依据物质所带阴阳离子的不同。电荷不同的物质，对管柱上的离子交换剂 有不同的亲和力，改变冲洗液的离子强度和pH值，物质就能依次从层析柱中分离出来。离子交换柱色谱操作技术：1.介质的选择和处理2. 装柱 3.平衡4.加样5.交换6.洗脱 7.树脂再生梯度洗脱:采用流动相的离子强度线性增大的洗脱方法。凝胶过滤色谱原理：凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被阻挡 在外部，从而使混合溶液中各种组分按分子质量不同进行筛分。对凝胶介质的要求： 亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任何化学或物理相互作用； 稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长； 具有
14、一定的孔径分布范围； 机械强度高，允许较高的操作压力（流速）凝胶过滤色谱出柱顺序：按分子由大到小顺序先后流出并得到分离。型号：Sephadex G-n（n越大，则交联度越小，而膨胀度、吸水量和筛孔直径则越大。） 亲和色谱的原理：利用生物分子间所具有的专一亲和力而分离。把与目的产物具有特异亲和 力的生物分子固定化后作为固定相,则当含有目的产物的混合物（流动相）流经此固定时, 即可把目的产物从混合物中分离出来。当配基较小时，将其直接固定在载体上，会由于载体的空间位阻，配基大分子不能发生有效 的亲和吸附作用。这时，需要在配基与载体之间连接一个“间隔臂”，使其发生有效的亲 和结合。第九章电泳技术PAG
15、E （polyacrylamide gel electrophoresis）:以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的一种电泳 方法。聚丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺单体为材料,N.N-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，在催 化剂作用下，把丙烯酰胺单体聚合成三维网孔结构的高分子聚合物。丙烯酰胺（Acr）单体的催化聚合原理：两种催化反应类型：化学催化和光催化 化学催化（最常用）过硫酸铵（APS）作为催化剂四甲基乙二胺（TEMED）作为增速剂 光催化核黄素作催化剂，TEMED作增速剂，需光照和氧分子的参与连续电泳：一般只有分离胶。电泳体系的缓冲液pH及凝胶浓度保持不变 不连续电泳：包括浓缩胶和分离胶。浓缩胶和分离胶的凝胶的孔大小、缓冲液成分及其 pH值都不连续。SDS-PAGE的原理是什么？有何应用？SDS-PAGE的原理是SDS能以一定比例和蛋白质结合并使蛋白质分子带有大量的负电荷，大 大超过其原来所带电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别下降乃至消除，同时使蛋白质 的结构也在SDS作用下变得松散，形状趋于一致，排除了电泳过程中电荷的影响，使蛋白质 迁移率的差异仅是相对分子质量的函数。主要应用是分离蛋白质和测定相对分子质量不连续PAGE的三大分离效应：
