《TUNEL染色检测细胞凋亡》由会员分享，可在线阅读，更多相关《TUNEL染色检测细胞凋亡（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法细胞凋亡中染色体DN的断裂是个渐进的分阶段的过程,染色体NA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300k的大片段。然后大约0 的染色体DNA在a 和g 依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断,形成1820bp核小体DA多聚体。DA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3-O末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（Td)的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUEL)。由于正常的或正
2、在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-O形成，很少能够被染色。低分子量的NA分离后,也可使用DA聚合酶进行缺口翻译（nck trsltin),使低分子量的NA标记或染色,然后分析凋亡细胞。UNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。一、过氧化物酶标记测定法原理:脱氧核糖核苷酸衍生物地
3、高辛（digoxiein)-11-d在TT酶的作用下,可以掺入到凋亡细胞双链或单链A的3-OH末端,与dAP形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下,过氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异准确的定位出正在凋亡的细胞,因而可在普通光学显微镜下进行观察。毛地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体，因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到,若此抗体的c部分通过蛋白酶水解的方法除去后,则可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用。本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰
4、冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定。(一)试剂配制1、磷酸缓冲液BS（pH74):磷酸钠盐 50m,Na 20m。2、蛋白酶K（2g/l，pH74）：蛋白酶K 002g；BS 10ml。 3、含%O2的PBS缓冲液（pH7.)：2 .0ml；PBS缓冲液 98.0ml。4、TdT酶缓冲液（新鲜配）：Trlza碱 3.63g用.1 HCl调节pH至 .2,加d2O定容到000ml；再加入二甲砷酸钠29g和氯化钴0.238g。、TdT酶反应液:TdT酶2l；TT酶缓冲液 76l,混匀,置于冰上备用。、洗涤与终止反应缓冲液:氯化钠7. 4;柠檬酸钠 8.82g；dd2O100ml7、0.05
5、%二氨基联苯（A)溶液：DB 5g;P 1l，pH7.4,临用前过滤后,加过氧化氢至0.%。8、05甲基绿（pH40):甲基绿0.;0.1M乙酸钠100l。9、10丁醇,10、5、90%、8和%乙醇,二甲苯,0中性甲醛溶液,乙酸,松香水等。1、过氧化物酶标记的抗地高辛抗体(ONCR)（二）实验步骤1、标本预处理：（1）石蜡包埋的组织切片预处理:将组织切片置于染色缸中,用二甲苯洗两次，每次5in。用无水乙醇洗两次，每次min。用5%和75%乙醇各洗一次，每次3mn。用PS洗5mn 加入蛋白酶溶液（20ug/l)，于室温水解15in,去除组织蛋白。用蒸馏水洗4次，每次mi,然后按下述步骤进行操作。
6、(）冰冻组织切片预处理:将冰冻组织切片置1%中性甲醛中，于室温固定0min后，去除多余液体。用PS洗两次,每次5min。置乙醇:乙酸（2:1）的溶液中,于-20处理5min，去除多余液体。用洗两次，每次in，然后按下述步骤2进行操作。（3)培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约 1个ml细胞于4中性甲醛室温中固定 10min。在载玻片上滴加 100细胞悬液并使之干燥。用PBS洗两次,每次n,然后按下述步骤进行操作。、色缸中加入含2过氧化氢的BS,于室温反应5mn。用BS洗两次,每次5min。3、用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体,立即在切片上加滴 Td酶缓冲液，置室温15min。4、 用
7、滤纸小心吸去切片周围的多余液体,立即在切片上滴加 4l Td酶反应液,置湿盒中于7C反应 1hr（注意:阴性染色对照，加不含TT酶的反应液)。5、将切片置于染色缸中，加入已预热到37的洗涤与终止反应缓冲液,于7保温30i,每10min将载玻片轻轻提起和放下一次，使液体轻微搅动。6、 组织切片用PS洗 3次,每次 mi后，直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体,于湿盒中室温反应0min。、用PBS洗4次，每次5mn。、在组织切片上直接滴加新鲜配制的.0%DAB溶液，室温显色36min。9、用蒸馏水洗4次,前3次每次1n,最后1次in。10、 于室温用甲基绿进行复染10mn。用蒸馏水洗次
8、,前两次将载玻片提起放下1次，最后1次静置30s。依同样方法再用00正丁醇洗三次。1、 用二甲苯脱水3次，每次2min,封片、干燥后,在光学显微镜下观察并记录实验结果。（三）注意事项一定要设立阳性和阴性细胞对照。阳性对照的切片可使用NseI部分降解的标本，阳性细胞对照可使用地塞米松（1）处理3-4hr的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞。阴性对照不加TT酶，其余步骤与实验组相同。TNEassayTeminal eoxynucloidyltransfera dUT nicke labeling（TUNEL) is aehod o detecingDNA rgentatio ylabelinghe
9、 erminlenofnulei acds.TUNEL a common mehod fo detecing DNA fagmentationthatresults from apopoticgnlin cascads. T ssay elies on th presence of nisin the DNAwch can be itifibterminal deoxynuleotiyl transferae,annzye tht willcatyze he addiion ofdUThat are secondailyabeld wit a makr.I may alo abel cel that ave sufere svere DNA amge.内容总结（1)TNL法检测细胞凋亡实验原理和方法细胞凋亡中染色体HYLK htt:/51prooccm/DA/idx.tml DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体YPERINK ttp:/5rtcl.co/A/ndx.html DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为00kb的大片段
