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1、精子获能著名美籍华裔科学家张明觉博士早年从事哺乳动物体外受精的研究。他从附睾尾部取出的精子或是射出的精子，用各种方法处理精子都不能使之与卵子在体外受精。后来他发现多种动物精子在雌性生殖道中运动的时间很短，而排卵后要间隔一定时闻才能受精，精子总是要等待卵子。也就是说，人及哺乳动物精子在离开生殖道时，还不能立即与卵子受精。它必须在雌性生殖道内经历一段成熟过程，才能获得受精能力。次年，奥地利科学家Austin将这一现象称之为精子获能。此后，大量事实证明，精子获能是所有哺乳动物精子受精前必须经历的一个生理阶段。数十年来，人们对获能现象进行了大量研究，累积了丰富的知识，并利用人工配置的培养液可对精子进行
2、体外获能。由于获能现象的揭示及其深入研究，体外受精技术获得突破，为人类直接观察受精过程奠定了基础，并导致了试管婴儿和试管动物的诞生。所以，获能的发现在生殖学史上有里程碑的意义。1.精子获能的部位获能的部位随物种而异。子宫和输卵管峡部都可能是精子获能的部位，但可能主要在子宫中进行。子宫射精型动物的获能从子宫开始，而阴道射精型动物则从精子穿越子宫颈时就开始了获能过程。子宫颈可分泌粘液，据阻隔精浆和死亡精子的筛选作用。只有活力较强的精子才能穿透粘液进入子宫腔。精子在穿越子宫颈粘液过程中可被除去其表面所黏附的精浆物质。随着精子向输卵管的运行，获能逐步进展。当到达输卵管峡部时，获能过程已接近完成。获能精
3、子暂时储存在峡部，等待奔向壶腹部与卵相遇。而进入壶腹部的精子，则基本完成获能并具备了与卵相互作用产生顶体反应的能力【1】。2.精子获能的条件2.1.雌性生殖道进入雌性生殖道的精子通过其自身尾部的摆动及雌性生殖道的蠕动进人输卵管，在此处，被输卵管上皮细胞(OEC)所黏附，阻止精子继续向前运动，从而在输卵管内形成了精子库。OEC优先结合未获能的精子，并在合适条件下，允许获能的或转化为超活化运动的精子从精子库中释放出来。获能过程中精子尾部鞭打式运动的强度与其从精子库中释出的能力相一致。精子与输卵管上皮细胞顶部质膜间的直接接触还可降低精子获能速率。输卵管上皮细胞顶部质膜调节了精子在体内获能的时机。这种
4、调节的生化机制目前还不清楚，但可能与精子细胞内Ca2+的调节有关。从一些动物生殖道液体内鉴定出许多种糖蛋白，据推测，其中与发情相联系的两种糖蛋白对精子获能和/或精子运动力可能起作用，其中一个是输卵管糖蛋白(OGP)，它是一个雌激素依赖分子，可直接影响精子及受精过程，但其具体作用及机制尚不清楚，另一个则是输卵管液过氧化氢酶(OFC)，对它的研究较为深入。OFC的活性自发情周期日开始逐渐升高，至排卵前达到最高水平。子宫及输卵管内存在特异氨基酸，在死亡精子的刺激下会产生过氧化氢，因此认为OFC是雌性哺乳动物生殖道内促进精子存活的重要因素【2】。2.2.蛋白质体内获能时雌性生殖道中自然存在较高的蛋白浓
5、度，而体外获能时若培养液缺乏血清蛋白，体外受精就不能成功。血清蛋白在体外起着胆固醇受体的作用【3】。半胱氨酸丰富分泌蛋白-1(CRISP-1)的D蛋白与精子的短暂联系对获能有抑制作用，但是E蛋白与精子结合后，其作用效应与CRISP-1是不一致的。D蛋白与E蛋白交链与精子上时，其作用机制也不一样【4】。2.3.离子浓度及其比例Ca2+、K+、Na+和HCO3-都是获能所必需的，尤其是细胞内较高浓度的游离Ca2+对获能起着至关重要的作用。2.3.1.Ca2+的作用精子获能初时，细胞内的Ca2+与在附睾中的相同，存在于精子顶体外缘。顶体膨胀为精子顶体反应初时，此时顶体外缘的Ca2+消失，其它部位也没
6、有Ca2+出现。顶体囊泡上有Ca2+，表明顶体反应时期有Ca2+出现，并且集中在精子顶体囊泡上。同时，精子顶体后区上也有Ca2+。随着精子顶体反应完毕，顶体帽脱落，顶体内膜暴露，此时顶体内膜上没有Ca出现.而顶体后区仍有Ca2+存在整个精子获能过程中，精子尾部Ca2+变化甚微，主要集中在线粒体及轴丝上。Ca2+-ATPase在精子获能和精子顶体反应过程中出现较短，即在精子获能前活性较高之后，活性降低，直至消失【5】。2.3.2.HCO3-的作用HCO3-对精子获能的重要作用体现如下：HCO3-调节精子内的PH变化。因为HCO3-是细胞内主要的缓冲离子，而且获能过程也与PH有关，当碱化作用受阻时
7、不能使精子获能。HCO3-在改变精子质膜结构和活性过程中起重要作用，而质膜的变化是精子获能的重要步骤。HCO3-引起精子表面的重塑，增加细胞质膜上脂类的混乱程度，改变磷脂类似物的跨膜运动。HCO3-调节精子膜电位。精子获能伴随着质膜的碱化作用，在精子获能过程中，增加HCO3-可以引起精子质膜表面的碱化作用，尽管目前精子获能过程中质膜发生碱化作用的功能尚不完全清楚，然而，有人推测在顶体反应与获能相关的膜的碱化作用，可能调节Ca2+的含量。HCO3-进入胞质内影响获能的机制还不完全清楚，可能与下面的途径有关：Na+依赖的Cl-/HCO3-交换可能受肝素影响，肝素与肝素结合蛋白的结合可能活化精子质膜
8、上阴离子运输蛋白。另外，从生理学角度看，附睾液中HCO-浓度较低，输卵管液中HCO3-浓度较高，且体外环境中的HCO3-已被显示与精子活化率成正相关。附睾液中低水平的HCO3-使精子处于非获能状态，而输卵管液中高水平的HCO3-有助于精子获能【6】。2.4.动情周期性时相精子体内获能还受动情周期性时相的影响。较早交配的精子要停留到排卵期才能获能，而于排卵时立即交配获能时间只要前者的一半即可达到同样效果，说明刚排卵后的雌性生殖道环境能加速精子的获能进程。2.5.多种激素或细胞因子存在于雌性生殖道内的多种激素或细胞因子对获能具有促进作用，目前已知的有血小板激活因子、孕酮、肝素和载脂蛋白等。其中，血
9、小板激活因子(PAF)的促获能作用近年来受到极大重视【1】。2.5.1.血小板激活因子(PAF)已经发现，多种动物精子表面含有PAF受体，在雄性生殖道中即能合成PAF。同时，精子中还含有PAF乙酰转移酶和PAF乙酰水解酶(PAF-AH)，前者可激活PAF，而后者使PAF失活。在精子获能过程中，去除PAF乙酰水解酶可促进PAF的合成，同时提高精子的运动能力和受精能力。由于PAF的上述作用，有些学者甚至将其视为获能因子的候选者【1】。精子随精液射人雌性生殖道内后，雌性生殖道内液体的偏酸性能使精浆PAF-AH失活和/或使PAF-AH与精子脱离。这样精子合成的PAF就有可能通过精子膜上的PAF受体发挥
10、作用来促进精子的获能。另外，雌性生殖道内液体的PAF-AH活性变化可能参与精子获能的调节。子官腔液体内PAF-AH活性的下调可以削弱母体子宫来源的PAF-AH对精子分泌的PAF的降解作用，从而为精子获能创造有利的条件。除了PAF-AH的活性发生变化外，雌性生殖道合成和分秘的PAF也可能对精子的获能起作用。子宫合成的PAF可能有两方面的作用：可能通过与精子质膜上的PAF受体结合直接促进精子的获能，也可能通过子宫内膜上的PAF受体结合来诱导子宫内膜合成和分泌一些促进精子获能的物质来间接参与精于获能，但这还有待进一步证明。PAF对精子获能的调节可能也受到雌性生殖道液体内的类固醇激素的调节。体外实验表
11、明，孕酮可以诱导精子获能。孕酮可能诱导精子内Ca2+浓度增加引发PAF的合成和释放，释放的PAF再通过PAF受体作用参与精于的获能。除孕酮外，雌激素对精子获能也有诱导作用。精于进入雌性生殖道后，雌性生殖道内的类固醇激素可能与精于接触进而促进精于合成和释放PAF，PAF再通过精子质膜上的PAF受体起作用来促进精子的获能。精于来源的PAF或子宫来源的PAF可能通过与精子质膜上与G蛋白偶联的质膜受体结合，激活磷脂酶C，后者再作用于4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)，使其分解为三磷酸肌醇(IP3)和二酰甘油(DG)。IP3通过内质网上的IP3受体作用促进内质网Ca2+库释放Ca2+。Ca2+对于精于
12、尾部的轴丝运动是必需的，高浓度的Ca2+还可以直接或者通过钙调素来调节一些蛋白激酶的活性。DG则激活蛋白激酶C(PKC)。PAF也可能通过G蛋白偶联的质膜受体激活腺苷酸环化酶产生cAMP来激活蛋白激酶A(PKA)。目前对PAF如何激活酪氨酸激酶活性的认识还有待深入，PAF有可能通过上述的IP3和cAMP信号通路来活化精子内的一些蛋白，这些蛋白中的一些可能本身就具有酪氨酸激酶活性，另一些可能参与调节具有酪氨酸激酶活性的细胞因子受体的作用。总之，PAF可能通过激活PKC、PKA和酪氨酸激酶使一些获能相关蛋白的丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸残基磷酸化，进而影响获能过程中的能量代谢和物质代谢【7】。2.5.2
13、.孕酮几乎所有的实验都证明由卵丘细胞分泌的孕酮和卵泡液内的孕酮都能诱发顶体反应。孕酮促进精子获能与诱导顶体反应可能都与胞质的Ca2+内流有关。孕酮诱导Ca2+内流与PKC途径和电压门控Ca2+通道机制有关。2.5.3.肝素肝素是硫酸化程度最高的氨基多糖，可增加cAMP的合成，提高pH值，并调节与获能相关的变化(如酪氨酸磷酸化)【8】。3.去获能现象不论体内或体外获能，精子所经历的第一个事件就是摆脱精浆的作用。早在1957年，张明觉就发现从输卵管回收的、已经在雌性生殖道获能的精子，如果再送回到精浆中，则已经获得的受精能力将再度失去，此即去获能现象。这说明精浆中可能含有某种去获能因子，也说明在某种
14、程度上获能是可逆的。迄今也已证明，精浆中来源于雄性生殖道不同段落的多种糖蛋白、过氧化物歧化酶等蛋白质均有抑制获能的作用。我国学者石其贤等证明，精浆中的胺类,尤其是精胺有很强的去获能效应，去除精胺，精子又可重新获能。因此，所谓去获能因子可能并非某种特定分子，而是精浆中一系列对精子功能有抑制作用的因素的综合效应。去除精浆后，随着抑制的解除，将使精子逐步激活，也许首先是代谢的激活，继而引起一系列机能变化，最终获得受精能力【1】。附睾液中的精子处于去获能的低活力状态，这可能与附睾液内存在高浓度的PAF-AH有关。已发现人和牛的附睾精液中PAF-AH活性较高，它可能将精子分秘的PAF水解为溶血-PAF，
15、从而阻止精子的激活，因此有人也把PAF-AH称为去获能因子。不过，已证实溶血-PAF和溶血-磷脂酰胆碱都能不同程度地增加精子的直线运动和曲线运动.因此溶血-PAF可能与维持附睾液内精子的低活力状态有关，这可能是最大限度地节约能量的一种需要【7】。4.精子在获能中产生的变化获能精子发生许多结构和生化变化，包括蛋白质酪氨酸磷酸化、精子膜胆固醇外流、活性氧的产生及精子超激活运动，这些变化都有助于精子获能的发生。4.1.蛋白质酪氨酸磷酸化(PTP)精子鞭毛是精子发生酪氨酸磷酸化的主要部位。除了猪外，人、猴、仓鼠、大鼠、马以及小鼠的精子鞭毛上皆有酪氨酸磷酸化蛋白的分布。在精子获能、精子与透明带结合以及与
16、配子融合期间，精子鞭毛上有大量蛋白发生酪氨酸磷酸化，且具有这些蛋白分布的精子数目也增多。顶体是精子蛋白酪氨酸磷酸化的另一重要部位，获能体系有利于精子发生酪氨酸磷酸化，尤其是提高精子顶体区域的磷酸化水平。未获能精子酪氨酸磷酸化的蛋白分布在精子尾部，获能后将转移至顶体区域，顶体是精卵结合区，因而这一蛋白酪氨酸磷酸化位点的转移具有重要的生理意义【9】。许多在精子获能期间发生酪氨酸磷酸化的蛋白已被确认并命名。人类精子上AKAP82和FSP95为主要的两种，其次VCP和AKAP3也发生酪氨酸磷酸化。二氢硫辛酰胺脱氢酶这一线粒体酶在获能期间也发生酪氨酸磷酸化。CABYR在获能期间也发生酪氨酸磷酸化，且在精子获能的分子信号转导过程中，它的这一修饰可能与Ca2+的作用存在交叉效应。精子获能也能诱导某些质膜蛋白发生酪氨酸磷酸化，从而激发精子与卵透明带结合，发生顶体反应【9】。目前发现精子细胞中可能存在四种信号传导
