WB注意事项及常见问题

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1、WB注意事项及常见问题WB注意事项及常见问题 注意事项 一、 样本收集 1. 组织样本 原则上要求客户或我们的技术员把组织分切剪碎至研磨管，并加入适量裂解液和研磨珠，然后放置于-80保存。具体详情参照“组织样本收集注意事项.doc”； 2. 细胞样品 原则上要求客户或我们的技术员不要用胰酶把细胞消化下来，特别是分选对象是膜蛋白时，具体详情参照“细胞样品收集注意事项.doc”； 二、 总蛋白提取 1. 组织样品 具体详情参照“组织样本收集注意事项.doc”；记得加入蛋白酶抑制剂，如果分选对象是磷酸化蛋白时，记得加入磷酸化酶抑制剂； 2. 细胞样品 具体详情参照“细胞样品收集注意事项.doc”；记

2、得加入蛋白酶抑制剂，如果分选对象是磷酸化蛋白时，记得加入磷酸化酶抑制剂； 三、 蛋白样本保存 裂解细胞或组织提取总蛋白时，细胞碎片沉淀一般-20保存以防万一，提取好的蛋白样品分装2份，一份加入上样缓冲液变性后-20保存，一份直接-20保存； 四、 蛋白变性 提取好的总蛋白取一部分加入上样缓冲液进行加热变性，变性好的蛋白应该-20保存，冻融后不再需要加热变性； 五、 SDS-PAGE 1. 浓缩胶的胶浓度一般为5%，用于压沉样品； 2. 分离胶的胶浓度取决于分析对象的分子量大小，详情见Western Blotting 全攻略.pdf第4页； 3. 分离胶和浓缩胶的高度比为8:3； 4. 电泳结束

3、后，应及时用清洗干净玻璃板，清洗时应使用海绵擦布，切勿使用刷子，以免刮花玻璃板； 5. 电泳结束后，应及时冲洗电泳槽，以免盐离子沉积，导致电泳丝腐蚀； 6. 清洗电泳芯时，一定要注意别弄段电泳丝； 六、 转膜 1. 注意海绵垫，滤纸，转印膜，胶的叠放位置，以保证正确的转印方向； 2. 注意海绵垫，滤纸，转印膜，胶的相对大小，以免造成短路； 3. 转印结束后，应及时取出转印膜，并立即用TBST漂洗1-2遍，并立即加入封闭液，这样可以避免膜上的杂质残留或膜变干导致背景高的问题； 4. 转印结束后，应及时冲洗转印槽和转印芯，以免盐离子沉积，导致电泳丝腐蚀； 5. 转印结束后，应及时用水泡洗海绵垫和滤

4、纸，以免盐离子沉积，导致转膜时短路，并放在篮子上晾干，如果海绵垫和滤纸不及时晾干，容易导致海绵垫和滤纸内部的结构破坏； 七、 封闭 1. 进行封闭时，应加入足量的封闭液，并保证整个封闭过程中，膜与封闭液充分接触，避免长时间离开封闭液，特别进行4静止封闭过夜时，一定要加入足量的封闭液和保证平坦放置；上述注意事项主要为了避免膜变干，导致背景升高； 八、 一抗杂交 1. 一抗的稀释比例：第一次使用时参考具体抗体说明书建议的稀释比例，并根据实际的实验结果进行调整； 2. 杂交条件：如果是室温孵育，至少保证孵育1-2小时，并放置脱色摇床上进行摇晃，如果是4孵育，应孵育过夜，可静止亦可放置脱色摇床上进行摇

5、晃； 3. 应使用专用的一抗稀释液进行稀释，使用后进行回收并4保存，如果回收的稀释抗体用沉淀或长菌，应丢弃； 九、 一抗杂交后洗膜 1. 一般使用标准的TBST缓冲液，如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高，可以把NaCl的浓度提高到500 nM (标准的为150nM); 2. 一般洗涤3次，每次10min，如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高，可以把洗涤次数提高到4-6次； 十、 二抗杂交 1. 二抗的稀释比例：第一次使用时参考具体抗体说明书建议的稀释比例，并根据实际的实验结果进行调整； 2. 杂交条件：一般室温孵育，孵育1小时即可，并放置脱色摇床上进行摇晃； 3. 应使用封闭液进行稀释，

6、使用后进行不回收； 十一、 二抗杂交后洗膜 1. 一般使用标准的TBST缓冲液，如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高，可以把NaCl的浓度提高到500 nM (标准的为150nM); 2. 一般洗涤3次，每次10min，如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高，可以把洗涤次数提高到4-6次； 十二、 拍照 1. 注意选择曝光时间，同时兼顾工作效率，因选择连续拍照模式，这样总有一个何时曝光时间； 十三、 报告单整理 1. 原始图片； 2. 对比度和亮度调整的图片； 3. 图片说明：上样顺序； 4. 灰度值：原始值，数据标准化，相对表达量的数据标准化比值），参照样品的相对表达量一定为1； 5. 实

7、验方法：准确的一抗，二抗，稀释比例； 常见问题 一、 没信号 1. 膜一片空白，没有任何条带，阳性对照样品也无条带：实验失败？抗体失效？；重新进行实验，重新稀释抗体； 2. 膜一片空白，没有任何条带，阳性对照样品有条带：实验样品降解？实验样品无该蛋白的表达？转膜效率过低？；重新进行实验，复核查找上述原因，以寻找对策； 二、 背景过高 1. 目的条带以外的区域有信号，如果是片状，甚至整块膜，一般是封闭不好，膜变干，一抗非特异杂交或二抗的非特异杂交导致；如果是条纹状，一般是由于膜上有压痕导致，如果是点状，一般是膜上有杂质，或泡膜时膜没有充分浸泡； 三、 杂带 1. 目的带以外的信号条带为杂带，一般

8、由于一抗的特异性不好所导致，如果目的带比杂带信号强，可通过减低一抗的稀释比例，并缩短杂交时间解决；如果目的带比杂带信号弱，在不减低一抗的稀释比例的前提下，缩短杂交时间；并提高TBST缓冲液的NaCl的浓度提高到500 nM； 2. 杂带如果与目的带的位置相距较远，可以不优化实验，直接裁剪即可，杂带如果与目的带的位置相距较进，应调整胶浓度，并延长电泳时间，已经采取上述解决方法； 四、 目的带弱 1. 一抗效价低：提高一抗稀释比例，提高杂交时间，减少洗膜次数，提高曝光时间，提高上样量； 2. 转膜效率低：检测转膜试剂和耗材，优化转膜条件； 五、 复合问题 上述问题往往同时出现，首先客观冷静分析问题所在，针对问题采取相应策略，有些策略可能互相矛盾，应以解决主要问题为主；